WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНОВ МОРСКИХ ЕЖЕЙ И НАРУШЕНИЕ ХОДА ЭМБРИОГЕНЕЗА ПРИ ЭКСПРЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОНКОГЕНОВ rolB И rolC 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток – 2008 2

Работа выполнена в Лаборатории биофизики клетки Института биологии моря имени А.В. Жирмунского ДВО РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, вед. н. с.

Одинцова Нэлия Адольфовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Исаева Валерия Васильевна член-корреспондент РАН, Михайлов Валерий Викторович

Ведущая организация:

Институт цитологии РАН

Защита состоится «_» февраля 2008 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д.005.008.01 при Институте биологии моря имени А.В. Жирмунского ДВО РАН по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17. факс: (4232) 310-900, e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря имени А.В. Жирмунского ДВО РАН.

Адрес: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17 Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

Автореферат разослан «_» января 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Ващенко М.А.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На сегодняшний день агробактериальная трансформация растений является самым изученным примером горизонтального переноса генов от бактерий к эукариотам in vivo. В ходе эволюции бактерии рода Agrobacterium (в соответствии с новой классификацией большинство видов реклассифицировано в род Rhizobium, однако большинство ученых, изучающих агробактериальную трансформацию растительных клеток, используют старое название) приспособились к переходу от сапротрофного типа питания к своеобразному паразитическому типу. Это происходит путем переноса в растительные клетки генов синтеза опинов (продуктов реакции кетосахаров и аминокислот) и генов, вызывающих неопластическую трансформацию клеток растений. В результате такой трансформации у растений появляются быстро делящиеся клетки, синтезирующие опины, которые служат для агробактерий источником углерода и азота. Агробактериальная трансформация нашла широкое применение в генной инженерии растений и сейчас является одним из распространенных методов генетической трансформации растений.

Наличие у ряда представителей некоторых групп морских беспозвоночных (кольчатые черви, моллюски, ракообразные, иглокожие) ферментов опинового синтеза позволило сделать предположение о возможном переносе генов опинсинтетаз от агробактерий к морским беспозвоночным. Вопрос о возможной агробактериальной трансформации животных клеток долгое время оставался открытым, пока в 2001 году не было показано на культуре клеток человека HeLa, что агробактерии могут трансформировать клетки млекопитающих (Kunik et al., 2001). Несколькими годами ранее было показано, что агробактерии могут трансформировать клетки грибов (Bundock, Hooykaas, 1996; Piers et al., 1996).

На сегодняшний день известно, что активация генов под контролем растительных промоторов (nos и 35S) в животных клетках возможна благодаря распознаванию их регуляторными элементами клетки-реципиента (Ballas et al., 1989; Zahm et al., 1989). Эти промоторы имеют либо вирусную природу (35S, вирус мозаики цветной капусты), либо агробактериальную (nos, бактерии рода Agrobacterium). Однако информации о функционировании именно регуляторных генов растений в клетках животных нет. Это особенно касается функционирования растительных онкогенов rol из Agrobacterium rhizogenes (Rhizobium rhizogenes) в связи с возможностью агробактериальной трансформации клеток животных.

В наших экспериментах мы показали, что в условиях морской среды in vitro может происходить агробактериальная трансформация при совместном культивировании эмбрионов морских ежей с агробактериями Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter), которые несут растительные онкогены rolB и rolC. У части эмбрионов нарушается ход эмбриогенеза с образованием опухолеподобных структур (ОПС). Такие структуры формируются на поверхности эмбрионов и получили свое название из-за внешнего вида.

Подобное нарушение эмбриогенеза было описано ранее после трансформации генетическими конструкциями, несущими ген универсального активатора транскрипции gal4 (Bulgakov et al., 2002). В наших исследованиях мы изучали строение эмбрионов с ОПС после трансформации плазмидной ДНК, несущей ген gal4, и после агробактериальной трансформации генами rolB и rolC. Это позволило выявить различия в строении эмбрионов с опухолеподобными структурами и в строении самих ОПС, а на основании этого установить, что возникновение опухолеподобных структур является следствием действия разных механизмов.

Цели и задачи исследования. При выполнении работы мы преследовали две цели. Во-первых, изучить явление агробактериального переноса Т-ДНК (transferred DNA, переносимая одноцепочечная ДНК) в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, доказать встройку чужеродной ДНК и активность перенесенных генов rolB и rolC. Во-вторых, изучить влияние растительных онкогенов rolB и rolC на ход эмбриогенеза морских ежей.

Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Подобрать и оптимизировать условия агробактериальной трансформации эмбрионов морских ежей в процессе их совместного культивирования со штаммами A. tumefaciens, которые несут бинарный вектор: pMP90RK (virхелперная плазмида) и pPCV002, содержащую в составе Т-ДНК один из генов rol (rolB или rolC). Определить возможные механизмы трансформации.

2. Оценить эффективность агробактериальной трансформации в сравнении с полиэтиленгликоль(ПЭГ)-опосредованной трансформацией плазмидными конструкциями, несущими чужеродные гены.

3. Доказать встройку Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, используя методы ПЦР и TAIL-ПЦР. Определить активность генов rolB и rolC методом обратно-транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР) после совместного культивирования эмбрионов с агробактериями.

4. Провести сравнительный морфологический анализ эмбрионов с опухолеподобными структурами, возникающими вследствие трансформации генетическими конструкциями, несущими ген gal4 и гены rolB и rolC.

Определить сходство и различие в строении эмбрионов и опухолеподобных структур после трансфекции.

Научная новизна и теоретическая значимость. В нашей работе впервые продемонстрирована возможность агробактериальной трансформации в условиях морской среды на примере эмбрионов морских ежей. Это является подтверждением гипотезы о переносе генов опинового синтеза от агробактерий к представителям различных групп морских беспозвоночных. Более того, нами зафиксирована встройка агробактериальной Т-ДНК в геномную ДНК морских ежей. Наряду с известным фактом трансформации клеток млекопитающих наши данные указывают на целенаправленный транспорт Т-ДНК в ядра клеток животных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2003), на I и IV Всероссийских симпозиумах по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2006), на международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2004), на Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании – 2006» (Калининград, 2006), на Х Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС, ТИБОХ, 2006) и на годичной научной конференции Института биологии моря имени А. В. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, включая 2 статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и содержит таблицы. Список литературы содержит 193 наименования.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума ДВО РАН (гранты 03-3-Ж-06-096, 04-3A-06-047, 06-II-СО-06025 и 06-III-В-06-214) и при финансовой поддержке НОЦ ДВГУ за счет средств фонда US CRDF (проектVL-003) и Министерства Образования РФ (А03-2.12-524).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Экспериментальную часть работы проводили на морской биологической станции «Восток» Института биологии моря имени А.В.

Жирмунского ДВО РАН (Приморский край, Находкинский район). Морских ежей (Scaphechinus mirabilis, Strongylocentrotus intermedius и S. nudus) собирали в заливе Восток Японского моря с июля по октябрь и держали в ваннах с проточной аэрированной водой. Нерест морских ежей стимулировали инъекцией 0,5 М KCl в область аристотелева фонаря.

Эмбрионов получали искусственным оплодотворением.

Для агробактериальной трансформации использовали штамм A.

tumefaciens GV3101, который несет бинарный вектор: pMP90RK (virхелперная плазмида) и pPCV002. Плазмида pPCV002 содержит в составе ТДНК один из онкогенов rol из A. rhizogenes (rolB либо rolC) и ген nptII, кодирующий неомицинфосфотрансферазу. Агробактериальную трансформацию проводили путем совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей с последующим добавлением антибиотика цефатоксима через 10-13 часов после начала эксперимента.

Для трансформации плазмидной ДНК с генами rol использовали штаммы Escherichia сoli TG2 с плазмидами pPCV002-rolC, pPCV002-rolВ и pPCV002. В эксперименте по изучению влияния гена gal4 мы использовали штамм E. coli TG2 с плазмидой pMA563, любезно предоставленной доктором М. Пташне (M. Ptashne, Гарвардский университет, США). Гены rol в плазмидах находятся под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, гены nptII и gal4 – под контролем нопалинсинтазного промотора nos. Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса.

Трансформацию плазмидной ДНК проводили ПЭГ-опосредованным методом (Bulgakov et al., 2002).

Для изучения влияния растительных онкогенов на ход эмбриогенеза мы использовали штамм A. tumefaciens А348, несущий одну из плазмид:

pTi237 (мутантный ген virA), pTi243 (мутантный ген локуса virB) или pTi(мутантный ген virG). Данные гены инактивированы вставкой транспозона Tn3-Ho-Hol (Stachel, Nester, 1986).

ДНК из эмбриональных культур выделяли согласно Т. Маниатису (Maniatis et al., 1982), с использованием буфера, содержащего р-р 7 М мочевины. Тотальную РНК выделяли из эмбрионов с помощью набора YellowSolve (Клоноген, Санкт-Петербург, Россия) с последующей обработкой ДНКазой (Amresco, США) и депротеинизацией сорбентом BlueSorb (Клоноген, Санкт-Петербург, Россия). Обратную транскрипцию проводили, используя набор фирмы Силекс М (Москва, Россия).

Доказательство трансгенности и экспрессии перенесенных генов проводили с помощью генспецифических ПЦР и ОТ-ПЦР с последующим секвенированием по методике, описанной ранее (Bulgakov et al., 2002;

Одинцова и др., 2003; Bulgakov et al., 2006). Доказательство встройки Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей проводили методом TAIL (thermal asymmetric interlaced)-ПЦР по схеме, описанной Я. Лиу с соавторами (Liu et al., 1995), с последующим клонированием продуктов реакции при помощи набора «InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit» (Fermentas, Vilnius, Литва) согласно протоколу фирмы-производителя. ПЦР-продукты клонированных фрагментов после TAIL-ПЦР были секвенированы при помощи пары праймеров M13. Генспецифические ПЦР-продукты секвенировали с праймерами, которые использовали при ПЦР фрагментов этих генов.

Реакцию проводили, используя набор реактивов «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit» V. 3.1 (Perkin-Elmer Biosystems, Forster City, США) по методике производителя. Последовательность фрагментов ДНК определяли на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Perkin-Elmer Biosystems, США) на базе Биолого-почвенного института ДВО РАН.

Для определения изменения pH в процессе культивирования мы проводили измерения pH морской воды в совместной культуре агробактерий (A. tumefaciens GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolC) и эмбрионов морских ежей в течение 3 суток. Измерения значения pH проводили при помощи pH-метра OR-211/1 с комбинированным электродом (Radelkis, Венгрия). В эксперименте ставили три параллели: 1) эмбрионы без добавления агробактерий; 2) эмбрионы с добавлением агробактерий; 3) эмбрионы с добавлением агробактерий и с добавлением цефатоксима через 12-13 часов совместного культивирования. Отдельно проводили измерение pH морской воды, которую брали для культивирования.

Морфологию эмбрионов исследовали методами световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Эмбрионы фиксировали 2% глютаральдегидом на изоосмотичном фосфатном буфере (исходя из того, что соленость морской воды 32‰) с последующей дофиксацией 1% тетраоксидом осмия на том же буфере. Материал заливали в смесь смол Эпон и Аралдит (Fluka, Швейцария), либо в Спурр (Sigma, США). Срезы получали на ультракате Ultracut-E (Reichert-Jung, Австрия). Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим (Уикли, 1975) и изучали под световым микроскопом Polyvar (Reichert-Jung, Австрия). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по методу Рейнольдса (Уикли, 1975) с последующим просмотром на электронном микроскопе JEM100S (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Локализацию пролиферирующих клеток в эмбрионах определяли методом иммуноцитохимического выявления включения 5-бромо-2'дезоксиуридина (БДУ). Для этого к эмбрионам морских ежей, культивируемым совместно с агробактериями (агробактериальная трансформация), через 24 часа после оплодотворения добавляли БДУ до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 8 часов (32 часа развития). Выявление включения БДУ проводили по протоколу Танаки и Дана (Ettensohn, Ruffins, 1993) с незначительными модификациями.

Статистические данные обработаны с помощью программы GraphPadPrizm (версия 4.0) и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка. Полученные данные оценивали по спаренному tкритерию Стьюдента. Уровень значимости 0,05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»