WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Определение гемолитической активности комплемента. Для исследования гемолитической активности комплемента in vitro нами был разработан способ реконструкции анализатора агрегации тромбоцитов SOLAR AP 2110, а также методика проведения эксперимента. Принцип метода заключается в регистрации изменений светопропускания раствора в процессе гемолитического распада эритроцитов. Метод позволяет наблюдать и контролировать ход измерений в динамике, а также хранить данные в виде электронных файлов. Всего выполнено 116 проб.

Исследование влияния приема соевого белка на протеолитическую и трипсин-ингибиторную активность крови человека. Исследование проводилось с участием врачей М.А. Штарберга и И.Г. Белоглазовой. Легитимность испытания на людях подтверждена Этическим комитетом ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» (выписка из протокола от 23 сентября 2007 г.). В экспериментальную группу вошли 28 взрослых (средний возраст 50 лет) практически здоровых людей. Среди них было 16 женщин и 12 мужчин.

Эксперимент длился 2 месяца, на протяжении которых добровольцы употребляли изолят соевого белка (ежедневно по 30 г на человека). Кровь для исследований брали до и после 2-х месяцев приема изолята. В сыворотке крови определяли общий уровень протеолитической и трипсинингибиторной активности.

Статистические методы. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ «StatPlus Professional 4.3.0.0» и «StatSoft Statistica 6.0». Различия между группами устанавливались по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение Обзор электронных баз данных белков В Интернете нами было найдено более 100 баз данных с информацией о различных веществах. Белкам посвящено около 50 баз (список приводится в диссертации), среди которых только 9 (табл. 1) содержат информацию об апротинине и СИТ, представленную в виде электронных файлов специального формата.

Таблица Базы белков, содержащие информацию об апротинине и СИТ Идентификационный код в базе Название и электронный данных адрес базы данных Апротинин СИТ UniProt-Swiss-Prot BPT1_BOVIN ITRA_SOYBN http://www.expasy.org/ (P00974) (P01070) Blocks http://www.ebi.ac.uk/ P00974 IPRCOG P00974;

- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NP_001001554;

GTOP btau0:ENSBTAG0000 atha0:At1ghttp://spock.genes.nig.ac.jp/ 0017328 60.iProClass P00974/BPT1_BOVI - http://pir.georgetown.edu/ N; PIRSFLIGAND – LIGAND 50059016; 3809839;

http://www.pasteur.fr/ bta:616039; - MMDB P00974 (Precursor);

1AVU http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 1QLQ PDB http://www.rcsb.org/ 1OA6 1AVU; 1BAMEROPS I02.001 I03.http://merops.sanger.ac.uk/ Определение степени гомологии аминокислотных последовательностей апротинина и СИТ in silico В ходе исследования установлено, что полипептидные цепи данных ингибиторов гомологичны на 10% (рис. 1).

Сравнение отдельных аминокислотных областей данных белков показало более высокий уровень гомологии (рис. 2). Наиболее гомологичными (35%) оказались С-концевая область СИТ (участок цепи 132-181) и молекула апротинина без 6 последних С-концевых аминокислот.

Рис. 1. Результаты подсчета гомологии апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI) в Bio Edit 5.0.9 (черным цветом выделены идентичные аминокислоты, серым – химически подобные).

Рис. 2. Результаты определения гомологичных областей полипептидных цепей апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI).

Согласно представлениям классической протеомики, эволюционно родственные белки, независимо от количества аминокислот, входящих в их состав, и различий третичной структуры, имеют консервативные области (домены), определяющие свойства белков. Например, в родственных глутамилэндопептидазах бактерий неизменны только пять аминокислотных остатков из 215 (Степанов, 1998). Поэтому полученные нами данные указывают на гомологию полипептидных цепей апротинина и СИТ.

Определение и сопоставление спектров биологической активности апротинина и СИТ in silico Нами были построены электронные структурные формулы апротинина и СИТ формата MOL для программы PASS (рис. 3).

Рис. 3. Полипептидная цепь апротинина.

В окне «Residues» приведена таблица обозначений аминокислот.

Выявлено 4 вида активности для апротинина и 3 для СИТ (рис. 4).

Программа показала, что данные белки являются ингибиторами ренина, ангиотензин- и эндотелин-превращающего ферментов.

Возможность проявления (drug-likeness) перечисленных эффектов практически одинакова у обоих ингибиторов. Также установлено, что исследуемые ингибиторы не обладают токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью.

Рис. 4. Спектр биологической активности апротинина и СИТ «Drug-Likeness» – вероятность проявления эффекта; Pa – вероятность наличия активности; Pi – вероятность отсутствия активности.

Построение электронных трехмерных третичных структур апротинина и СИТ in silico В исследовании механизма действия и биологических функций белковых соединений большую ценность представляет их трехмерная структура (Blundell et al., 2006; Pazos, Bang, 2006; Silveira et al., 2007).

Поэтому с целью более тщательного изучения функциональности и выявления молекул-мишеней, нами были построены электронные пространственные структуры апротинина и СИТ (рис. 5).

Рис. 5. Электронные трехмерные модели третичных структур апротинина и СИТ (построено в программе Chem Office 5.0).

Произвести поиск молекул-мишеней методами биоинформатики не удалось из-за отсутствия необходимых программ в свободном доступе. В целом, полученные методами биоинформатики данные показали статистически достоверную степень структурной и функциональной однотипности апротинина и СИТ, что явилось предпосылкой дальнейших исследований in vitro и in vivo.

Трипсин-ингибиторная активность апротинина и СИТ in vitro Результаты определения активности отображены на рисунках 6 и 7.

Для сравнения мы определили активность синтетических ингибиторов.

Установлено, что трипсин-ингибиторная активность снижается в следующей последовательности: апротинин (141,1±13,3 ИЕ/мг), СИТ (61,4±0,9 ИЕ/мг), D-лизин (1,31±0,02 ИЕ/мг), -аминокапроновая кислота (1,36±0,04 ИЕ/мг). Таким образом, активность апротинина при данном способе расчета более чем в 2 раза выше таковой СИТ (р<0,0002).

Рис. 6. Трипсин-ингибиторная активность апротинина (1), СИТ (2), -аминокапроновой кислоты (3) и D-лизина (4) в ингибиторных единицах (ИЕ) на 1 мг вещества.

Рис. 7. Трипсин-ингибиторная активность апротинина (1) и соевого ингибитора трипсина (2) в ингибиторных единицах (ИЕ) на 1 нмоль вещества.

Ингибиторная активность синтетических низкомолекулярных ингибиторов на 2 порядка ниже, чем у апротинина, и в 40 раз ниже, чем у СИТ. Учитывая, что молекулярная масса СИТ (20 100) в 3 раза выше, чем у апротинина (6 514), при расчете на моль ингибитора активность первого будет несколько выше (см. рис. 7).

Исследование системы свертывания крови и фибринолиза in vitro В условиях in vitro нами было проведено исследование воздействия апротинина, СИТ и трипсина на ряд показателей свертывания крови и противосвертывающей системы. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица Влияние апротинина, СИТ и трипсина на показатели свертывания крови и фибринолиза in vitro Время, сек Плазма Плазма + Плазма + Плазма + Показатель (контроль) 0,1% р-р 1,0% р-р 1,0% р-р трипсина апротинина СИТ (1) (2) (3) (4) Протромбиновое 13±0,9 21±0,9 31±0,20±0,время Р1-2<0,0001 Р1-3>0,05 Р1-4<0,3±0,9 113±1,8 105±2,АЧТВ 36±1,Р1-2<0,0001 Р1-3<0,0001 Р1-4<0,Тромбиновое 2,5±0,5 24±0,16±0, * время Р1-2<0,0001 Р1-3<0,Лизиса Лизиса Время 182±400±34,7 сгустка не сгустка не фибринолиза Р1-2<0,происходило происходило Примечание. * – в некоторых пробах наблюдалось слабое помутнение через 300 секунд. АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время.

Установлено, что протромбиновое время уменьшается на 3335% при воздействии 0,1% раствора трипсина, незначительно возрастает (не более 5%) при воздействии 1,0% раствора апротинина и увеличивается практически вдвое при воздействии 1,0% раствора СИТ. АЧТВ снижается в 10-12 раз при воздействии 0,1% раствора трипсина, возрастает в 3 раза при воздействии 1,0% раствора апротинина или 1,0% раствора СИТ.

Образование сгустка под действием тромбина (тромбиновое время) усиливается на 85% в присутствие 0,1% раствора трипсина, замедляется на 50% в присутствие 1,0% раствора апротинина и не происходит в присутствие 1,0% раствора СИТ. Фактор XII-калликреинзависимый фибринолиз ускорятся на 50-60% при воздействии 0,1% раствора трипсина и не протекает в присутствие 1% растворов апротинина или СИТ. Результаты исследования указывают на однотипность биологического воздействия апротинина и ингибитора трипсина из соевых бобов в отношении изученных физиологических процессов.

Исследование агрегации тромбоцитов in vitro Исследование проводили на АДФ- и адреналин-инициируемой типах агрегации. Результаты представлены в таблице 3 и на рисунках 8 и 9.

Таблица Влияние апротинина, СИТ и трипсина на агрегацию тромбоцитов in vitro Контроль Плазма + Плазма + Плазма + Тип агрегации (плазма) Апротинин СИТ Трипсин (1) (2) (3) (4) Обрат. (Адф) Р1-2<0,01 Р1-3<0,01 Р1-4<0,МА 22±1,8 14±0,9 15±0,9 34±0,Р1-2<0,3 Р1-3<0,3 Р1-4<0,ТМА 55±4,7 55±4,7 55±4,7 65±Двухфаз.(Адф) Первая фаза Р1-2<0,01 Р1-3<0,01 Р1-4<0,МА 48±1,8 35±0,9 34±1 57±Р1-2<0,001 Р1-3<0,005 Р1-4<0,ТМА 85±4,7 68±10,5 70±9 80±Вторая фаза Р1-2<0,02 Р1-3<0,05 Р1-4<0,МА 70±2 56±2 58±1 99±Р1-2<0,001 Р1-3<0,001 Р1-4<0,ТМА 350±9,2 325±9,2 320±9,3 310±9,Необрат.(Адф) Р1-2<0,02 Р1-3<0,02 Р1-4<0,МА 49±0,9 33±0,9 29±0,9 Р1-2<0,04 Р1-3<0,04 Р1-4<0,ТМА 400±18 410±9,3 410±9,3 210±26,Двухфаз.(адр) Первая фаза Р1-2<0,02 Р1-3<0,02 Р1-4<0,МА 23±0,9 16±1,8 16±1,8 32±0,Р1-2<0,001 Р1-3<0,001 Р1-4<0,ТМА 110±9,3 125±13,1 125±13 130±9,Вторая фаза Р1-2>0,05 Р1-3>0,05 Р1-4<0,МА 47±2,4 44±2 44±1,8 55±0,Р1-2<0,0001 Р1-3<0,0001 435±ТМА 390±9,3 430±18 430±18 Р1-4<0,П р и м е ч а н и е. МА – максимальный уровень агрегации (процент светопропускания), ТМА – время достижения максимального уровня агрегации в секундах, адр – адреналин, Обрат. – обратимая агрегация, Необрат. – необратимая агрегация, Двухфаз. – двухфазная агрегация.

Рис. 9. Типичные агрегатограммы влияния апротинина, СИТ и трипсина на адреналин-инициируемую двухфазную агрегацию тромбоцитов in vitro (адреналина 25 мкмоль). 1 – контроль; 2-3 – СИТ 1,0% (апротинин 1,0%); 4 – трипсин 0,1%.

Рис. 8. Типичные агрегатограммы влияния апротинина, СИТ и трипсина на АДФ-инициируемую двухфазную агрегацию тромбоцитов in vitro (АДФ 15 мкмоль). 1 – контроль; 2 – апротинин 1,0%; 3 – СИТ 1,0%; – трипсин 0,1%.

Ингибиторы факторов свертывания являются на сегодняшний день основным объектом исследования в работах, посвященных регуляции агрегации тромбоцитов (Klauss, Spannagl, 2006; Jennings, Saucedo, 2008). В литературе имеются данные об успешном применении некоторых серпинов как регуляторов агрегации (Rothman, 2005; Nutescu, Shapiro, Chevalier, 2006; Lepor, 2007; Fareed et al., 2008a, 2008b; Hoppensteadt et al., 2008). Мы поставили перед собой задачу исследовать влияние апротинина и СИТ на процесс агрегации тромбоцитов. В ходе исследования было установлено, что апротинин и СИТ тормозят процесс агрегации тромбоцитов in vitro, а трипсин оказывает обратный ингибиторам эффект.

Антиагрегационные свойства исследуемых ингибиторов протеолитических ферментов практически не отличаются.

Исследование влияния апротинина, СИТ и трипсина на систему комплемента in vitro Ингибиторы протеаз участвуют в различных протеолитических каскадах организма, в том числе в активации комплемента (Silverman et al., 2004; Richardson, Viswanathan, Lucas, 2006). Поэтому одним из объектов данного сравнительного исследования биологической активности панкреатического ингибитора протеаз и соевого ингибитора мы выбрали систему комплемента как протеолитическую систему (рис.

10, табл. 4).

Рис. 10. Типичные кривые влияния апротинина, СИТ и трипсина на гемолитическую активность комплемента in vitro.

Таблица Влияние апротинина, СИТ и трипсина на скорость гемолиза эритроцитов в присутствии системы комплемента in vitro Общее время Время лагфазы, мин гемолиза включая лагфазу, мин Контроль (1) 3,5±0,5 8,5±1,Р1-2>0,05 Р1-2>0,Апротинин (1,0%) (2) 3,2±0,15 7,25±0,Р1-3>0,05 Р1-3>0,СИТ (1,0%) (3) 3,2±0,15 7,25±0,Р1-4<0,02 Р1-4<0,Трипсин (0,01%) (4) 4,25±0,25 15,5±0,Мы предполагали, что исследуемые ингибиторы смогут препятствовать работе комплемента, тем самым увеличив время гемолиза.

Однако было установлено, что скорость гемолиза не изменяется при воздействии апротинина и СИТ. Такой эффект ингибиторов можно объяснить их специфичностью к протеазам. Трипсин угнетает активность комплемента, возможно, потому что компоненты последнего гидролизируются трипсином.

Влияние приема изолята соевого белка на протеолитическую и трипсин-ингибиторную активность в сыворотке крови В рамках исследования протеолиза, затрагивающего систему крови, мы поставили перед собой задачу выяснить, как длительное употребление в пищу продуктов, содержащих активные ингибиторы протеолитических ферментов, может влиять на протеазно-ингибиторную систему организма человека. В качестве такого продукта был выбран изолят соевого белка, обладающий антипротеолитической активностью. В процессе приготовления изолята соя подвергается термической обработке, в ходе которой биологически активные компоненты могут инактивироваться, в том числе и ингибиторы. Известно, что около 20% соевого ингибитора трипсина обладают термостабильностью (Kennedy, 1998). Поэтому для корректной оценки показателей общей активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в сыворотке крови, было определено содержание ингибиторов в изоляте соевого белка. Определение показало, что 1 мг изолята соевого белка содержит 1,4±0,1 ингибиторных единиц (ИЕ).

Установлено, что прием изолята соевого белка на протяжении месяцев сопровождался статистически достоверным снижением общей протеолитической активности сыворотки крови на 18% (р<0,05) и увеличением трипсин-ингибиторной активности на 21% (р<0,01) (табл. 5).

Таблица Уровень протеолитической и трипсин-ингибиторной активности в сыворотки крови людей, употреблявших изолят соевого белка Показатели сыворотки крови Время Общая протеолитическая исследования Трипсин-ингибиторная активность сыворотки активность (ИЕ/мл) (относительные единицы) До приема 0,343±0,010 113±3,После приема 0,282±0,008 р<0,05 137±5,3 р<0,Полученные данные позволяют предполагать, что употребление активных ингибиторов в составе пищевых продуктов может оказывать влияние на физиологические процессы, сопряженные с протеолизом.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»