WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Памирский Игорь Эдуардович АНАЛИЗ СТЕПЕНИ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОДНОТИПНОСТИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ, И СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА 03.00.13 – физиология 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Благовещенск – 2009 2

Работа выполнена на кафедре биологической химии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, Бородин Евгений Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Лукьянова Ольга Николаевна доктор биологических наук, профессор, Новгородцева Татьяна Павловна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «12» ноября 2009 г. в 10-00 на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 005.008.03 при Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН по адресу: 690041, г.Владивосток, ул.Пальчевского, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.

Автореферат разослан « 1 » октября 2009 г.

Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, к.м.н. А.Ю. Горькавая 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ферментативный гидролиз белков (протеолиз) лежит в основе регуляции важных физиологических процессов (переваривание белковых компонентов пищи, образование кровеносных сосудов, иммунный ответ, секреция) на разных уровнях организации (Seiki, Yana, 2003; Chondrogianni, Gonos, 2008; Skrko-Glonek, SobieckaSzkatua, 2008). Протекание протеолиза обеспечивается большим количеством протеолитических ферментов (протеаз), которые способны функционировать внутри и вне клеток. Типичными представителями ферментов класса протеаз являются трипсин, калликреин, тромбин, плазмин, урокиназа, пепсин, дуоденаза, катепсины. Протеолиз регулируется преимущественно белками-ингибиторами, составляющими мощный антипротеолитический потенциал организма. Белки-ингибиторы встречаются в организмах млекопитающих, червей, микробов и растений (Zavasnik-Bergant, 2008). Предотвращая преждевременную и чрезмерную активность, либо полностью блокируя работу протеолитических ферментов, ингибиторные белки участвуют в механизмах многих сопряженных с протеолизом процессов, таких как свертывание крови, распад фибринового сгустка, активация комплемента и других.

Функциональная деятельность ингибиторов не ограничивается влиянием на протеазы, они также могут препятствовать действию цитокинов, токсинов и ряда других биологически активных веществ (Зорин и соавт., 1995).

Особую группу белков-ингибиторов животного происхождения составляют серпины. Серпины ингибируют сериновые протеазы – ключевые ферменты, отвечающие за функционирование и взаимосвязь физиологических систем организма (пищеварение, иммунитет, гемостаз и др.). К характерным представителям данной группы белков относят гирудин, 1-антитрипсин, 2-макроглобулин и другие. Особый интерес представляет поливалентный ингибитор протеаз (апротинин), выделенный из органов крупного рогатого скота, который активно практикуется как регулятор протеолиза в организме человека. Аналоги белковингибиторов животного происхождения обнаружены у таких растений как табак, горчица, картофель, пшеница, соя и другие (Дунаевский и соавт., 2005; Мосолов, Валуева, 2005). В частности, к ним относятся ингибиторы из соевых бобов, способные препятствовать действию сериновых протеаз, подобно серпинам. К сожалению, вопрос о структурной и функциональной однотипности протеазных ингибиторов, присутствующих в организмах животных и растений, имеет существенные пробелы. Поэтому в качестве объектов сравнения были выбраны поливалентный ингибитор протеаз поджелудочной железы животных (апротинин) и соевый ингибитор трипсина. Кроме того, актуальность данного исследования обуславливается исключительно важной ролью регуляторов протеолиза в функционировании физиологических процессов.

Цель работы: проанализировать степень структурной гомологии и функциональную однотипность апротинина животного происхождения и соевого ингибитора трипсина (СИТ).

Задачи исследования:

1. Методами биоинформатики установить степень структурной гомологии, спектр биологической активности и определить потенциальные молекулы-мишени апротинина и СИТ из числа протеаз организма человека.

2. Определить трипсин-ингибиторную активность апротинина и СИТ в опытах in vitro.

3. Изучить влияние апротинина и СИТ на свертывание крови (протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время и тромбиновое время).

4. Определить влияние апротинина и СИТ на фибринолиз (время фибринолиза).

5. Сравнить влияние апротинина и СИТ на агрегацию тромбоцитов (скорость и степень агрегации).

6. Проанализировать влияние апротинина и СИТ на функциональное состояние системы комплемента (гемолитическая активность комплемента).

7. Изучить влияние приема изолята соевого белка, содержащего соевый ингибитор трипсина, на общую протеолитическую и трипсинингибиторную активности в сыворотке крови людей.

Научная новизна исследования. Впервые методами биоинформатики показана высокая структурная гомологичность белкового ингибитора протеаз животного происхождения апротинина и его растительного аналога – соевого ингибитора трипсина (СИТ).

Сравнение электронных структурных формул позволило выявить, что оба соединения являются ингибиторами ренина, а также ангиотензинпревращающего и эндотелин-превращающего ферментов. Апротинин и СИТ не обладают токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью. Произведено построение электронных трехмерных третичных структур изученных соединений, что необходимо для расчета молекул-мишеней.

Впервые приведены доказательства, что апротинин и СИТ имеют не только структурное, но и функциональное сходство. Они в одинаковой степени ингибируют трипсин в опытах in vitro. При исследовании влияния на гемостатические показатели в опытах in vitro апротинин и СИТ препятствуют свертыванию крови (СИТ замедляет время свертывания по внутреннему и внешнему пути, а апротинин только по внутреннему) и блокируют фибринолиз. Оба соединения оказывают антиагрегационное действие, не различаясь между собой по силе торможения обратимой, двухфазной, необратимой АДФ-инициируемой и двухфазной адреналининициируемой агрегации. Растворы апротинина и СИТ в концентрации 0,01-1,0% не влияют на скорость и интенсивность комплемент-зависимого гемолиза.

Впервые получены данные, свидетельствующие, что двухмесячный прием соевого белка, содержащий активный СИТ, снижает общую протеолитическую и увеличивает трипсин-ингибиторную активность сыворотки крови.

Положения, выносимые на защиту:

1. На уровне первичной структуры белки апротинин и СИТ являются низкогомологичными соединениями. Наиболее высокий уровень сходства наблюдается между С-концевым участком полипептидной цепи СИТ и молекулой апротинина.

2. Апротинин и СИТ проявляют высокую степень функциональной однотипности в отношении трипсина и физиологических показателей гемостаза.

Теоретическая значимость. Получены новые знания о структурной гомологии и функциональной однотипности апротинина и соевого ингибитора трипсина. Эти данные расширяют недостаточно разработанные представления о физиологической роли апротинина и соевого ингибитора трипсина в регуляции функциональных процессов организма (свертывание крови, фибринолиз, работа системы комплемента, агрегация тромбоцитов).

Исследование дополняет современное знание о воздействии экзогенных ингибиторов протеаз растительного и животного происхождения на плазменные белки, обеспечивающие гемостатическую и защитную функции крови человека.

Результаты данного исследования позволяют глубже понять механизмы ряда физиологических процессов (гемостаза, неспецифических гуморальных и клеточных защитных механизмов), сопряженных с протеолизом.

Практическая значимость. В работе продемонстрирована адекватность использования ряда методов биоинформатики в исследовании гомологии белковых ингибиторов протеаз. Показана возможность перспективного использования соевого ингибитора протеаз в качестве регулятора протеолиза в организме, в частности процессов гемостаза. По результатам исследования оформлена приоритетная заявка на выдачу патента на изобретение «Способ коррекции общего уровня трипсин-ингибиторной активности сыворотки крови с помощью соевого печенья, обогащенного активным соевым ингибитором». Предложен метод исследования гемолитической активности комплемента in vitro.

Новые данные о структурно-функциональной гомологии белковингибиторов протеаз, содержащихся в животных и растительных объектах, представляют интерес для поиска аналогов этих соединений с заданными биологическими свойствами.

Материалы диссертации включены в курс лекций кафедры биологической химии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Практические рекомендации:

1. Используемые нами электронные базы белков содержат актуальную и достоверную информацию и могут применяться в исследовании белковых ингибиторов как средство биоинформатики.

2. Употребляя изолят соевого белка, обладающий антипротеазной активностью, можно корректировать уровень общей протеолитической активности сыворотки крови.

3. Полученные данные можно использовать при поиске и разработке новых регуляторов протеолиза в организме человека.

Апробация диссертации. Результаты исследования доложены и обсуждены на VII и VIII региональных научно-практических конференциях «Молодежь 21 века» (Благовещенск, 2006, 2007), X Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2006), IV Международном Российско-Китайском фармацевтическом форуме (Благовещенск, 2007) и XV Российско-Японском медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья в журнале, включенном в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», утвержденный ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах компьютерного набора. Она содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, описание собственных результатов, обсуждение и выводы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 209 первоисточников, из них 58 отечественных и 151 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Объект исследования. Препараты апротинина («Контрикал», Германия) и соевого ингибитора трипсина («Reanal», Венгрия). Всего выполнено 684 пробы.

Биоинформационные методы (in silico). Для сравнения гомологии аминокислотных последовательностей использовали интернет-сервер BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) и программу Bio Edit 5.0.9.

Спектр возможных биологических активностей определяли при помощи программ ISIS Draw 2.4 и PASS Professional. Для построения и визуализации электронных пространственных структур белков использовали программы Chem Office 5.0 и Yasara 6.2.5. Для работы с программами использовали файлы формата FASTA, MOL и PDB. С программами и сервером работали согласно прилагаемым инструкциям.

Также применяли базы данных белков (Protein Data Bank, Uni Prot и др.).

Определение протромбинового времени (метод Квика).

Протромбиновое время определяли с помощью тест-наборов «Техпластин-тест» («Технология Стандарт», Россия) в соответствии с прилагающейся инструкцией. Опытные образцы плазмы с трипсином и ингибиторами предварительно инкубировали на водяной бане в течение минут при 370С. Всего выполнено 48 проб.

Определение тромбинового времени. Тромбиновое время определяли с помощью тест-наборов «Тромбин-тест» («Ренам», Россия).

Определение проводили в соответствии с инструкцией к тест-набору.

Плазму с трипсином или ингибиторами инкубировали 5 минут на водяной бане при 370С. Всего выполнено 48 проб.

Определение активированного частичного тромбопластинового времени. Активированное частичное тромбопластиновое время свертывания крови определяли с помощью тест-наборов «Коагуло-тест» («Ренам», Россия). Образцы плазмы с трипсином и ингибиторами инкубировали на водяной бане в течение 5 минут при 370С. Всего выполнено 48 проб.

Определение времени фибринолиза. Время фибринолиза определяли с помощью тест-наборов «Фибринолиз-тест» («Технология Стандарт», Россия) по прилагаемым инструкциям. Образцы опытной плазмы с трипсином или ингибитором предварительно инкубировали на водяной бане в течение 5 минут при 370С. Всего выполнено 48 проб.

Исследование агрегации тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов в плазме исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов AP («Солар», Беларусь), совмещенного с ПЭВМ, по методу указанному в инструкции к прибору. Опытную плазму с трипсином или ингибиторами предварительно инкубировали в термостате в течение 5 минут при 370С.

Всего выполнено 116 проб.

Определение трипсин-ингибиторной активности. Определение трипсин-ингибиторной активности исследуемых ингибиторов проводили по методу В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1977). Трипсинингибиторную активность определяли в сыворотке крови добровольцев (60 проб), солянокислых растворах исследуемых ингибиторов (80 проб) и растворах изолята соевого белка (60 проб).

Определение протеолитической активности. Определение общего уровня протеолитической активности в сыворотке крови проводили по методу В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1977). Выполнено 60 проб.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»