WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Видно, что присутствие в смеси твитчина резко меняет зависимость вязкости от концентрации: при концентрациях Ф-актина 0.15 мг/мл и ниже твитчин увеличивает, в то время как при более высоких концентрациях - уменьшает вязкость Ф-актина. Вероятно, твитчин-актиновый комплекс, сформированный при низких концентрациях, обладает большей асимметрией, чем Ф-актин. С другой стороны, с увеличением концентрации смеси асимметрия образующихся частиц, по-видимому, уменьшается.

Отсутствие обычной линейной зависимости вязкости Ф-актина от концентрации указывает на то, что в растворах с низкой ионной силой Фактин взаимодействует с твитчином.

Таким образом, вискозиметрические данные однозначно подтверждают способность твитчина взаимодействовать с актином. Однако это происходит только в том случае, когда твитчин дефосфорилирован.

На рисунке 4 показано влияние дефосфорилированного и фосфорилированного твитчина на вязкость Ф-актина в растворах с низкой (50 мМ KCl), физиологической (175 мМ KCl) и высокой (300 мМ KCl) ионной силой. Дефосфорилированный твитчин увеличивает вязкость Фактина при 50 мМ KCl и 175 мМ KCl до уровней, которые намного выше суммы вязкостей Ф-актина и твитчина. Как и ожидалось, твитчин не изменяет вязкость Ф-актина в растворах с высокой ионной силой. В растворах с физиологической и низкой ионной силой фосфорилированный твитчин, в отличие от дефосфорилированного, не увеличивает вязкость Фактина (рис. 4).

Рис. 4. Вязкость твитчин-актиновых смесей в растворах с различной ионной силой и ее зависимость от фосфорилирования твитчина.

Концентрация Ф-актина – 0.05 мг/мл, твитчина – 0.2 мг/мл. Состав среды (в мМ):

50, 175 или 300 KCl, 2 MgCl2, 0.5 ЭГТА, 0.5 ДTT и 25 имидазол-HCl (pH 7.0).

А – Ф-актин; А + TW – сумма отдельно измеренных вязкостей твитчина и актина;

TW + A – смесь твитчина и Ф-актина; (TW + ПKA) + А – смесь фосфорилированного твитчина и Ф-актина. Твитчин фосфорилировали посредством ПКА (70 U) при комнатной температуре в течение 60 мин.

Состав твитчин-актиновых комплексов Итак, нами показано, что в растворах с низкой ионной силой дефосфорилированный твитчин взаимодействует с актином. Образующиеся комплексы и агрегаты комплексов могут быть осаждены центрифугированием при высокой или низкой скорости, соответственно. Состав осадков, полученных низкоскоростным центрифугированием твитчин-актиновой смеси в условиях, когда Ф-актин не осаждается (15 000g) показан на рисунке 5.

Видно, что количество осаждаемого Ф-актина возрастает с увеличением концентрации твитчина (рис. 5, дорожки 1-6), а в случае смеси, в которой концентрация Ф-актина составляет 0.1 мг/мл, а твитчина – 0.мг/мл (дорожка 6), осадок содержит приблизительно весь актин смеси.

Рис. 5. Низкоскоростное осаждение смесей твитчина с Ф-актином.

Дорожки 1-6 – осадки смеси Ф-актина (0.1 мг/мл) с разными концентрациями твитчина: (мг/мл) 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 и 0.4, соответственно; дорожка 7 – то же, что на дорожке 6, но был использован фосфорилированный твитчин, дорожка 8 – смесь 0.1 мг/мл Ф-актина и 0.4 мг/мл твитчина. Дорожки 8-10 – результаты эксперимента по механическому извлечению твитчин-актинового комплекса. ИС – исходная смесь, “С” – “супернатант”, “О” – “осадок”. Белки смешивали в стандартном растворе и центрифугировали при 15000g в течение 30 мин.

Таким образом, полное осаждение Ф-актина в присутствии твитчина происходит при отношении актина к твитчину как 1:4. Это указывает на то, что в разбавленных растворах полное связывание актиновых нитей твитчином требует молярного избытка последнего.

Осаждение смеси двух белков в тех же концентрациях и условиях (отношение Ф-актина к твитчину = 1:4 по весу), но с использованием фосфорилированной формы твитчина, приводит лишь к незначительному осаждению Ф-актина (рис. 5, дорожка 7).

Следует отметить, что при низкоскоростном осаждении осадок твитчин-актинового комплекса наблюдался только при использовании растворов с низкой ионной силой (75 мМ KCl). Увеличение ионной силы раствора до 150 мМ KCl (с использованием тех же молярных соотношений и концентраций белков) приводило к тому, что при центрифугировании твитчин-актинового комплекса при 15000g осадок не образовывался, хотя при центрифугировании этих же препаратов при 100000 g осадок появлялся (см. рис. 6).

Интересно, что твитчин-актиновый комплекс, сформированный в присутствии 75 мМ KCl без перемешивания, образует трехмерную структуру, которая может быть полностью удалена из раствора тонкой стеклянной палочкой. На рисунке 5 показан белковый состав такой структуры (дорожка 10), состав «супернатанта» после удаления структуры (дорожка 9) и состав исходной смеси белков (дорожка 8). Видно, что удаленная фракция содержит практически весь Ф-актин начальной смеси и минорную часть твитчина (отношение актина к твитчину – 1:0.2 по весу).

Высокоскоростное соосаждение двух белков в условиях, когда один из них не осаждается, широко используется для обнаружения белок-белкового взаимодействия. В случае взаимодействия белков, в осадке находится не только белок, обычно осаждающийся в этих условиях, но и белок, с ним взаимодействующий.

Использование высокоскоростного соосаждения в нашем случае выявило более сложную картину твитчин-актинового взаимодействия.

Оказалось, что результаты соосаждения сильно зависят от выбранных экспериментальных условий. При условиях, представленых на рисунке (дорожки 1-4) осадки формировались как на дне, так и на стенке пробирки и содержали небольшое, приблизительно одинаковое количество твитчина (дорожки 3 и 4). Однако при низком отношении твитчина к актину осадок на стенке содержал намного больше твитчина, чем осадок на дне пробирки (не показано). Мы предполагаем, что появление двух осадков связано с гетерогенностью твитчин-актинового комплекса. Комплексы могут включать как большие частицы, обогащенные твитчином, так и маленькие частицы, обогащенные актином.

Рис. 6. Высокоскоростное соосаждение твитчина с Ф-актином.

Твитчин (0.4 мг/мл), Ф-актин (0.2 мг/мл или 2 мг/мл) смешивали в растворе, содержащем 75 или 150 мМ KCI.

ИС – исходная смесь до центрифугирования, С – супернатант, О – осадок, О1 – осадок на стенке пробирки, О2 – осадок на дне пробирки. Ультрацентрифугирование при 100000g в течение 2 часов.

В тоже время, твитчин-актиновый комплекс, сформированный в присутствии 150 мМ KCl, осаждается одним осадком на дне пробирки и содержит такое же незначительное количество твитчина (рис. 6, дорожка 7), как в случае 75 мМ KCl (рис. 6, дорожки 3 и 4). Следует отметить, что значительная часть твитчина после высокоскоростного центрифугирования остается в супернатанте (рис. 6, дорожки 2 и 6). Однако использование более концентрированных растворов Ф-актина заметно увеличивает количество связанного твитчина (рис. 6, дорожки 8-10).

Таким образом, взаимодействие твитчина и Ф-актина может быть обнаружено как низкоскоростным, так и высокоскоростным центрифугированием в растворах с низкой и физиологической ионной силой.

In vitro фосфорилированный посредством ПКА твитчин не образует с Фактином осаждаемый комплекс (рис. 5, дорожка 7).

Влияние твитчина на механохимическую активность актомиозина Как показано выше, твитчин способен взаимодействовать с Ф-актином, который является основой тонкой нити, и это взаимодействие зависит от фосфорилирования твитчина. С другой стороны, твитчин способен взаимодействовать с миозином (Yamada et al., 2001) и другими белками толстой нити – парамиозином и миородом, причем все эти взаимодействия не зависят от степени фосфорилирования твитчина (Shelud’ko et al., 2007). Эти данные позволяют предположить образование твитчином регулируемых сшивок между толстыми и тонкими нитями. Такие сшивки должны модифицировать механо-химические свойства актомиозиновых моделей.

На рисунке 7А показано влияние твитчина на «спонтанную» суперпреципитацию (СПП) синтетического актомиозина, т.е. на его механические свойства, а на рисунке 7B показано влияние твитчина на АТФазную активность этого актомиозина. В этих экспериментах механические и химические свойства комплексов измерялись параллельно, с использованием одних и тех же препаратов.

«Спонтанная» СПП нерегулируемого актомиозина наблюдается в условиях пониженного сродства миозина к актину, когда после добавления Mg2+-АТФ к актомиозину следует сначала фаза просветления суспензии, а затем спонтанный рост ее оптической плотности (рис. 7А, кривая АМ). В фазе просветления миозиновые мостики находятся, в основном, в диссоциированном состоянии, что напоминает состояние «расслабления» регулируемого актомиозина. Со временем фаза просветления переходит в СПП, поскольку уменьшается концентрация Mg2+-АТФ за счет гидролиза АТФ в фазе просветления (Spicer, 1952). Переход к спонтанной СПП сопровождается сильным увеличением АТФазной активности (рис. 7В, кривая АМ). Механизм «спонтанной» СПП хорошо изучен, включая связь между механо-химическими и оптическими явлениями (Shelud’ko and Kropacheva, 1996), и поэтому эта модель удобна для тестирования влияния твитчина на свойства актомиозина.

B 0.A AM+TW 0.AM+TW 0.AM ATФ AM 0.0.05 0.0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 Время (мин) Время (мин) Рис. 7. Влияние твитчина на «спонтанную» суперпреципитацию (А) и Mg2+АТФазную активность синтетического актомиозина (В), реконструированного из «природного» Ф-актина мидии и миозина кролика.

Концентрация миозина – 0.15 мг/мл, Ф-актина – 0.1 мг/мл, твитчина – 0.05 мг/мл.

Состав среды (в мМ): 75 KCl, 2 NaN3, 0.1 CaCl2, 0.25 АТФ, 2 MgCl2, 20 имидазол-HCI (pH 7.2).

Твитчин, добавленный к актомиозину при его реконструкции, принципиальным образом меняет его механо-химические свойства. Такой актомиозин в условиях «спонтанной» СПП отвечает на добавление Mg2+АТФ «немедленной» СПП (рис. 7А, кривая АМ+TW) которая, как и положено «немедленной» СПП, сопровождается высокой АТФазной активностью (рис. 7В, кривая АМ+TW) (уменьшение АТФазной активности со временем в этих экспериментах связано, в основном, с уменьшением концентрации АТФ, поскольку АТФ-регенерирующая система не использовалась). Как уже говорилось, фаза просветления наблюдается в условиях пониженного сродства миозина к актину, поэтому очевидно, что эффект твитчина связан с усилением сродства миозина к актину. Мы полагаем, что твитчин образует сшивки между актиновыми и миозиновыми нитями, создавая благоприятные условия для их взаимодействия.

На рисунке 8 показано влияние твитчина на «расслабление» регулируемого синтетического актомиозина, реконструированного из тонких нитей мидии и миозина кролика. Интересно, что при относительно невысокой Са2+-чувствительности тонких нитей (50-70%), их комплекс с миозином кролика полностью суперпреципитирует («сокращается») в присутствии кальция и полностью «расслабляется» в его отсутствии (рис. 8).

---при 663 нM нмоль/мг /мин х АТФазная активность Оптическая плотность Рис. 8. Образование Са2+- чувствительного комплекса тонких нитей мидии и миозина кролика в присутствии Са2+ (сплошная линия) и в отсутствие Са2+ (прерывистая линия) и влияние на этот комплекс Мg2+-АТФ и твитчина. Жирной линией показана АТФазная активность комплекса в условиях расслабления до и после добавления твитчина.

Концентрация миозина – 0.05 мг/мл, тонких нитей мидии – 0.05 мг/мл, твитчина – 0.005 мг/мл. Состав среды (в мМ): 30 KCl, 0.5 MgCl2, 1 ЭГTA или 0.1 CaCl2, 0.3 Mg2+ATФ, 20 имидазол-HCl (pH 7.2).

Добавление твитчина к такому актомиозину в условиях расслабления приводит к сильному увеличению оптической плотности при неизменно низком уровне АТФазной активности. Таким образом, как в случае нерегулируемого актомиозина, «расслаблению» которого соответствует фаза просветления (рис. 7), так и в случае регулируемого «расслабленного» актомиозина (рис. 8), добавление твитчина приводит к агрегации толстых и тонких нитей. Эта агрегация не связана с усилением актин-миозинового взаимодействия, поскольку добавление твитчина в условиях расслабления не приводит к увеличению АТФазной активности, а ее увеличение в фазе просветления нерегулируемого актомиозина определяется подавлением этой фазы.

Гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» Экспериментальные результаты, представленные в настоящей работе, позволили нам сделать предположение о том, что дефосфорилированный твитчин может самостоятельно образовывать in vivo механические сшивки между толстыми и тонкими нитями, которые поддерживают catch-состояние независимо от миозиновых поперечных мостиков, т.е. предложить новый вариант «независимой» гипотезы механизма запирательного сокращения.

Гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» предполагает существование параллельной системы мостиков между толстыми и тонкими нитями с независимой регуляцией.

Обнаруженное нами взаимодействие твитчина с фибриллярным актином, зависимое от фосфорилирования твитчина, подтверждено Фунабарой с сотр. (Funabara et al., 2005), и гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» уже используется нашими коллегами при интерпретации экспериментальных данных (Hopflinger et al., 2006; Butler et al., 2006; Franke et al., 2007; Funabara et al., 2007).

Теоретически этой гипотезе может соответствовать три механизма запирательного сокращения:

1. Твитчин-актиновые связи выполняют регуляторную роль Этот вариант, в конечном счете, сводится к «мостиковой» гипотезе с той лишь разницей, что влияние твитчина на актин-миозиновое взаимодействие реализуется через актин, а не через миозин. Похоже, что такой точки зрения придерживаются Фунабара и сотр. (Funabara et al., 2005), которые считают, что связывание дефосфорилированного твитчина с актином усиливает взаимодействие миозиновых мостиков с актином, что и приводит к развитию catch.

2. Твитчин-актиновые связи являются catch-сшивками Поскольку catch-сшивки присутствуют не только в catch-состоянии, но также во время активного сокращения (Ruegg, 1971; Butler et al., 1998;

Andruchov et al., 2006), эти сшивки должны препятствовать работе миозиновых мостиков, генерирующих силу. Так как этот эффект не наблюдается (Butler et al., 1998), то должен быть специальный механизм, предотвращающий торможение активных мостиков пассивными. Например, есть предположение о том, что catch-сшивки ведут себя подобно «трещетке» (Andruchov et al., 2006). Это означает, что catch-сшивки обладают высоким сопротивлением силе, когда мышечное волокно удлиняется, и низким сопротивлением при его укорочении. В работах Фунабары с сотр. (Funabara et al., 2007) и Франка с сотр. (Franke et al., 2007) предлагается иное решение данной проблемы – миозин и твитчин конкурируют за места связывания на тонких нитях, в результате чего в каждый момент времени с тонкими нитями взаимодействует только один белок.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»