WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

МАТУСОВСКАЯ Галина Геннадьевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТВИТЧИНА ЗАПИРАТЕЛЬНЫХ МЫШЦ МОЛЛЮСКОВ С ФИБРИЛЛЯРНЫМ АКТИНОМ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток – 2008 2

Работа выполнена в лаборатории биофизики клетки Института биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской Академии наук Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Шелудько Николай Семенович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Жадан Петр Михайлович доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ламаш Нина Евгеньевна Ведущая организация Институт цитологии РАН

Защита состоится 25 сентября 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.005.008.01 при Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.

Адрес: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17 Факс: (4232) 310-900 E-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им.

А.В. Жирмунского ДВО РАН.

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

Автореферат разослан 24 августа 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Ващенко М.А.

3 Актуальность проблемы Мышцы являются специализированными структурными элементами, способными трансформировать химическую энергию в механическую работу. Несмотря на то, что строение и функция мышц разнообразны, общие принципы их работы одинаковы. Согласно теории скользящих нитей, мышечное сокращение обусловлено активным скольжением тонких актиновых нитей относительно толстых миозиновых нитей без изменения их длины. Работа мышцы заключается в циклической смене двух ее состояний:

сокращения в результате повышения концентрации Ca2+ в саркоплазме и расслабления при ее понижении. Известно лишь одно исключение из этого правила - гладкие мышцы двустворчатых моллюсков способны поддерживать еще одно состояние – запирательный тонус или catchсостояние, при котором мышца при низкой концентрации Ca2+ остается сокращенной в течение длительного времени. При этом высокое значение поддерживаемой силы сочетается с низким расходом энергии. Это явление, описанное более ста лет назад, хотя и свойственно ограниченному кругу мышц, тем не менее, вызывает повышенный интерес исследователей, поскольку его механизм трудно объяснить в рамках современных представлений о механизмах биологической подвижности.

Механические свойства нативных и демембранизированных волокон запирательных мышц моллюсков свидетельствуют о том, что в основе catch лежит образование поперечных сшивок между элементами сократительного аппарата. Выдвинуты две гипотезы, конкретизирующие это положение:

«мостиковая», постулирующая в качестве искомых сшивок особое ригороподобное состояние актомиозиновых мостиков (Lowy et al., 1964), и «независимая» или «парамиозиновая» гипотеза, которая постулирует наличие независимой системы поперечных связей. Предполагается, что такими связями являются сшивки между толстыми нитями (Johnson et al., 1959).

Мышцы, способные к запирательному тонусу, обладают необычными толстыми нитями, которые имеют большие размеры (10-20 мкм), и в их основе лежит парамиозиновый стержень, составляющий около 60% от массы толстых нитей. На поверхности парамиозинового стержня располагается миозин (Szent-Gyorgyi et al., 1971), твитчин (Vibert et al., 1993) и миород (Shelud’ko et al., 1999). Выход из состояния запирательного тонуса стимулируется серотонинэргическим нервом, что приводит к фосфорилированию твитчина (Siegman et al., 1997). В связи с этим открытием «мостиковая» гипотеза была уточнена. Предполагается, что дефосфорилированный твитчин, взаимодействуя с миозином, придает миозиновым мостикам свойства catch-сшивок, в то время как фосфорилированный твитчин не меняет цикл работы миозиновых мостиков (Butler et al., 2001; Funabara et al., 2001; Yamada et al., 2001, 2004).

Хотя «мостиковая» гипотеза catch является общепринятой и тестируется длительное время, убедительных доказательств ее правильности не получено. Более того, накапливаются экспериментальные данные, которые не согласуются с этой гипотезой (Siegman et al., 1997; Sugi et al., 1999; Galler et al., 1999; Takahashi et al., 2003).

В данной работе предложена новая «независимая» гипотеза запирательного сокращения – гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» («twitchin–actin linkage hypothesis»). Она основана на обнаруженной нами способности твитчина непосредственно взаимодействовать с фибриллярным актином, причем это взаимодействие регулируется фосфорилированием твитчина таким же образом, как распад и образование catch-сшивок in vivo.

Согласно этой гипотезе, твитчин является одновременно и регуляторным и исполнительным белком, образуя в дефосфорилированном состоянии catchсшивки между толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков.

Наши данные о способности твитчина взаимодействовать с фибриллярным актином противоречат ранее опубликованным данным Ямада и сотр. (Yamada et al., 2001), однако подтверждены Фунабарой и сотр.

(Funabara et al., 2005).

Цель и задачи исследования Целью работы было выяснение роли твитчина в механизме запирательного тонуса гладких мышц двустворчатых моллюсков.

Были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать методы препаративного выделения твитчина, миозина и актина из гладких мышц мидии Crenomytilus grayanus.

2. Провести поиск условий взаимодействия твитчина с фибриллярным актином.

3. Исследовать физико-химические свойства твитчин-актинового комплекса и влияние твитчина на механохимическую активность актомиозина.

Положения, выносимые на защиту 1. Твитчин из запирательных мышц двустворчатых моллюсков взаимодействует с фибриллярным актином.

2. Взаимодействие твитчина и актина регулируется фосфорилированием твитчина.

3. Твитчин-актиновое взаимодействие может быть основой запирательного сокращения мышц двустворчатых моллюсков, обеспечивая поперечные catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями.

Научная новизна полученных результатов Впервые показано, что гигантский белок твитчин способен взаимодействовать с фибриллярным актином, и это взаимодействие зависит от степени фосфорилирования твитчина. Взамен общепринятой «мостиковой» гипотезы запирательного тонуса (Lowy et al., 1964) предложена гипотеза «твитчин-актиновых сшивок», согласно которой дефосфорилированный твитчин образует catch-сшивки между толстыми и тонкими нитями запирательных мышц моллюсков.

Теоретическое и практическое значение работы Предложенная гипотеза «твитчин-актиновых сшивок» открывает новые возможности экспериментального исследования механизма запирательного сокращения и стимулирует поиски аналогичных систем в других мышцах, обладающих тоническими свойствами.

В работе детально описаны методы выделения и очистки сократительных белков, а также способы образования синтетических сократительных моделей, которые могут быть использованы в других исследованиях в области биологической подвижности.

Апробация работы и публикации Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино, 2001, 2004, 2006), VIII Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005) и ежегодной научной конференции Института биологии моря им. А.В. Жирмунского (Владивосток, 2005). По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе – 5 работ в рецензируемых изданиях из списка ВАК.

Финансовая поддержка работы Данная работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 05-04-49895) и Конкурса проектов ДВО РАН (грант № 06-III-В-06206).

Структура и объем работы Диссертация изложена на 104 страницах, состоит из «Введения», глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение результатов», выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Рукопись содержит 19 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение и очистка белков Миозин, твитчин и «природный» Ф-актин выделяли из мышц аддуктора мидии Crenomytilus grayanus (мидия Грея) (Shelud’ko et al., 2001, 2004, 2007). На рисунке 1 приведен пример электрофореграммы, на которой отражены основные этапы комплексного метода выделения основных сократительных белков из гладких мышц мидии. В данном случае показан ход получения конечного препарата твитчина (дорожка 11) и промежуточных препаратов миозина (дорожка 7) и «природного» Ф-актина (дорожка 5).

Комплексный метод позволяет получать препаративные количества необходимых в эксперименте белков в одном выделении.

Рис. 1. Основные этапы выделения и очистки твитчина.

1 – мышечный гомогенат, 2 – толстые нити, 3 – остаток после экстракции поверхностных белков толстых нитей (парамиозиновая основа толстых нитей), 4 – поверхностные белки толстых нитей, 5 – 0-33% сульфатно-аммонийная фракция поверхностных белков, 6 – 33-43% сульфатно-аммонийная фракция поверхностных белков, 7 – 43-65% сульфатно-аммонийная фракция поверхностных белков, 8 и 9 – осадок и супернатант фракции 33-43% после ее диализа против раствора с низкой ионной силой, 10 и 11 – твитчин до и после хроматографической очистки, соответственно.

Твитчин фосфорилировали в присутствии каталитической субъединицы протеин киназы А (ПКА, Sigma) согласно Фунабара с сотр.

(Funabara et al., 2003).

Скелетный миозин выделяли из спинных мышц и мышц задних конечностей кролика (Margossian and Lowey, 1982). Из мышечного остатка после выделения миозина готовили ацетонизированный порошок и далее получали скелетный Ф-актин (Shelud’ko et al., 2007).

Чистоту и состав препаратов сократительных белков из гладких мышц моллюсков оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) (Laemmli, 1970) с некоторыми модификациями (Шелудько, 1975; Shelud’ko et al., 1999).

Концентрацию белков определяли биуретовым методом или методом Бредфорда.

Определение оптических свойств Оптическую плотность растворов и суспензий белков и белковых комплексов измеряли посредством спектрофлуориметра Спекол-11 (Carl Zeiss, Jena) с использованием приставки EK-1. Размер частиц белковых комплексов определяли лазерным дифракционным измерителем размера частиц (Laser Diffraction Particle Sizer 3600Ec, Malvern).

Измерение вязкости Вязкость измеряли при низких градиентах скорости методом «падающего шарика» (Pollard and Cooper, 1982). Рассчитывали приведенную уд/C и характеристическую вязкость []= (уд/C)C 0.

Низкоскоростное и высокоскоростное центрифугирование Эти методы использовались для тестирования взаимодействия твитчина с Ф-актином в условиях образования крупных агрегатов (осаждаемых при 15000 g) и для соосаждения твитчина с Ф-актином (g) в условиях, когда взаимодействие этих белков не приводит к агрегации их комплексов. Перед образованием комплексов для низкоскоростного центрифугирования твитчин и Ф-актин осветляли при такой же скорости, как и при последующем осаждении комплексов. Перед высокоскоростным осаждением осветляли только твитчин. Условия центрифугирования были подобраны таким образом, чтобы оба белка не осаждались при низкоскоростном центрифугировании, и только Ф-актин осаждался при высокоскоростном центрифугировании. Осадки на дне и стенках пробирки промывали и солюбилизировали в 8.5 М мочевине с 5 мМ ЭДТА.

Измерение АТФ-азной активности актомиозина АТФ-азную активность синтетического актомиозина, включающего Фактин кролика или «природный» Ф-актин мидии, миозин кролика или мидии и твитчин определяли методом Херса, который представляет собой модификацию метода Фиске-Суббароу (Fiske and Subbarow, 1925).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Твитчин способен взаимодействовать с Ф-актином Тестирование взаимодействия твитчина с актином проводили оптическими и гидродинамическими методами. На рисунке 2 показано изменение оптической плотности смеси двух белков – твитчина и Ф-актина в зависимости от времени. Оптическая плотность смеси этих белков в растворах с низкой ионной силой намного превышает сумму оптических плотностей отдельно взятых белков, что указывает на образование комплекса этих белков, т.е. взаимодействие этих белков в данных условиях.

(TW+3ч)+A 0.(TW+ИПК+ПKA+0.5ч)+A (A+ПKA+0.5ч+ИПК)+TW 0.0.(TW+ПKA+0.5ч)+A 0.(TW+ПKA+3ч)+A 0.0 5 10 15 20 25 30 Время (мин) Рис. 2. Изменение оптической плотности после смешивания твитчина и Ф-актина.

Концентрация Ф-актина – 0.2 мг/мл, твитчина – 0.4 мг/мл. Состав среды (в мМ): KCl, 2 MgCl2, 0.5 ЭГТА, 0.5 ДTT, 2 NaN3, 0.5 ФМСФ, 0.5 леупептин, 25 имидазол-HCl (pH 7.0).

(TW+3ч)+А – твитчин (0.32 мг) инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов и смешивали с Ф-актином; (TW+ИПК+ПКА+0.5 ч) + А – твитчин (0.мг) инкубировали в присутствии ингибитора протеин киназы (ИПК) (20 мкг) и ПКА (U) в течение 0.5 ч и смешивали с Ф-актином; (A+ПKA+0.5ч+ИПК)+TW – Ф-актин (0.мг) инкубировали в присутствии ПКА (30U) в течение 0.5 ч, затем добавляли ИПК (20 мг) и твитчин; (TW+ПKA+0.5 ч) + А – твитчин (0.32 мг) инкубировали в присутствии ПКА (30 U) в течение 0.5 ч и смешивали с Ф-актином; (TW + ПKA + 3 ч) + А – то же, что и в последнем случае, за исключением 3-х часовой инкубации.

400 нМ Оптическая плотность при При формировании комплекса с использованием in vitro фосфорилированного твитчина посредством каталитической субъединицы ПКА наблюдается существенное уменьшение значений оптической плотности твитчин-актиновой смеси (рис. 2). Увеличение времени инкубации до 3-х часов (нижняя кривая) практически ингибирует взаимодействие между актином и твитчином.

Таким образом, по данным оптической плотности твитчин и актин взаимодействуют в среде с низкой ионной силой, но это взаимодействие ослабляется и исчезает по мере фосфорилирования твитчина.

Аналогичный вывод был сделан на основании данных вискозиметрии.

На рисунке 3 показана зависимость приведенной вязкости Ф-актина от его концентрации и влияние на нее твитчина.

Рис. 3. Влияние твитчина на приведенную вязкость Ф-актина.

Твитчин и актин смешивали в растворе, содержащем (в мМ): 75 KCl, 2 MgCI2, 0.ЭГТА, 0.5 ДTT и 10 имидазол-HCl (pH 7.0). Отношение актина к твитчину – 1:1 по весу.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»