WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Для определения количественных показателей субпопуляций лимфоцитов использовался метод непрямой иммунофлюоресценции с (флюоресцеинизотиоцианат) FITC – конъюгатами против иммуноглобулинов мыши. Определяли относительное и абсолютное содержание Т- и В- лимфоцитов и отдельных субпопуляций иммунокомпетентных клеток: СD3, СD4, СD8, СD16 и СD20 (n= 91). Определяли активированные лимфоциты трех фенотипов: СD25+ (экспрессирующие рецептор к интерлейкину-2), который считается маркером “ранней” активации; фенотип СD95+, выявляющий Fas – антиген, опосредующий апоптоз клеток (n=41); фенотип HLA-DR+, антиген, экспрессирующийся на В-клетках и активированных Тлимфоцитах, более характерный для длительной антигенной стимуляции – маркер «поздней» активации (n=54). Группа контроля оценки содержания активационных лимфоцитов состояла из 21 донора.

Проведено исследование содержания иммуноглобулинов G, A, M классов методом радиальной иммунодиффузии по методу Манчини (1965) у 94 больных РС и у 36 доноров.

Фракционный состав иммунных комплексов (ИК) исследовали по методу Фролова В.М. и соавт. (1986) преципитацией 2%, 3,75%, 5,5% растворами полиэтиленгликоля 6000 М, в боратном буфере с рН 8,4 с последующей спектрофотометрией на фотометре КФК-3-01 при длине волны – 450 нм. Исследование содержания фракционного состава ИК (крупно-, средне-, мелкомолекулярных фракций) выполнено у 38 больных РС и у доноров.

Статистическая обработка материала проведена с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). Использовались методы описательной статистики, непараметрический метод сравнения двух независимых величин, корреляционный анализ. При анализе вида распределения исследованных признаков использован критерий Шапиро - Уилка. Распределение признаков описывалось средними значениями и среднеквадратичными отклонениями (М±SD). В случае нормальных распределений для сравнения средних значений в группах использовался Ткритерий Стъюдента. Признаки, распределение которых отличалось от нормального, описывались медианами (Ме) и интерквартильными отрезками между нижним (LQ) и верхним (UQ) квартилями в формате Me[LQ;UQ]. Для сравнения связанных групп по количественным и качественным признакам использовался непараметрический метод Манна-Уитни. Для оценки сопряжённости использовался ранговый корреляционный анализ с применением критерия Спирмена и тау-Кендалла. Для всех видов статистического анализа различия считались статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование адгезивной активности лейкоцитов крови и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки При анализе результатов определения ИСА и ЭУс-а у больных РС выявлены различия этих показателей по сравнению с контролем и больными с ДНЗ (табл. 1).

Таблица Показатели адгезивной активности лейкоцитов и сыворотки крови в сравниваемых группах (M±SD; Me[LQ;UQ]) Показатели РС Доноры ДНЗ Р ИСА 26,93± 11,62 20,56± 7,72 32,35±12,90 рI-II=0,(значения 23[18;35] 18[14;27] 30[23;40] рI-III= 0,ИСА) (n=79) (n=23) (n=31) рIII-II= 0,ЭУс-а 0,40 0,17 0,24 рI-II=0, (доля от n) (n=100) (n=53) (n=33) При РС значения ИСА колебались от 11% до 63% (табл. 2), средний показатель составил 26,93±11,60%, что отличалось от контрольной группы (р=0,01), в которой значения ИСА колебались от 9% до 38%, а средний показатель ИСА составил 20,56±7,72%. В группе больных с ДНЗ диапазон колебаний составил от 14% до 64%, и среднее значение ИСА было выше, чем в группе контроля (р=0,0002). При анализе результатов было выделено три диапазона показателей ИСА (табл. 2): низкие значения ИСА до 20%, средние - от 21 до 30% и высокие - ИСА> 30%.

Таблица Результаты определения индекса спонтанной адгезии у больных РС и лиц контрольных группы Группа Группа Группа больных сравнения контроля Частота встречаемости РС (ДНЗ) + (норма)* различных диапазонов ИСА n = 79 n=31 n=% от числа обследованных лиц (в скобках - абс. число).

I. Низкие показатели ИСА: 36,7% (29) 19,4%(6) 56,5% (13) до 20 %.

II.Средние показатели ИСА: 29,1% (23) 32,25% (10) 34,8% (8) от 21% до 30% III.Высокие показатели ИСА: 34,2% (27) 48,4% (15) 8,7% (2) > 30% *р = 0,01 *р =0,Весь диапазон значений ИСА в группах от 11 до 63% от 14 до 64% от 9 до 38% В группе контроля максимальный показатель ИСА составил 38% и лишь у 2 доноров он превышал 30%. В группе больных РС и ДНЗ встречались значительно более высокие значения этого показателя (до 64%).

ИСА >30 ИСА>* 50% * 45% 40% * 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% РС Норма ДНЗ * р<0,05 по сравнению с нормой Рис.1. Структура высоких значений ИСА в сравниваемых группах Высокие показатели ИСА (>30%) значительно чаще, чем в группе контроля, встречались у больных РС (р=0,01) и в группе больных с ДНЗ (р=0,001). В структуре высоких значений ИСА выделен диапазон «очень высоких» показателей - более 40% (рис.1), который чаще отмечался при РС (р=0,05) и ДНЗ (р=0,01). Второй показатель, который анализировался в работе - эффект усиления адгезии под действием аутосыворотки (ЭУс-а), выявлялся у больных РС значительно чаще, чем в группах сравнения (р=0,003) и группе ДНЗ (табл.1).

При проведении анализа показателей адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови в подгруппах больных РС с различным характером течения, а также с длительностью и тяжестью заболевания, выявлена их наибольшая взаимосвязь с типом течения РС (рис.2).

Высокие ИСА ЭУс-а Очень высокие ИСА 70% * * + 60% * 50% * * * 40% + * 30% * * 20% 10% 0% ППРС ВПРС РРС-о РРС-р РС-д норма ДНЗ * p<0,05 по сравнению с нормой + р<0,05 по сравнению с ДНЗ Рис. 2. Частота выявления высоких значений ИСА и ЭУс-а при разных типах течения РС Максимально частое выявление высоких значений ИСА (р=0,0009) и ЭУс-а (р=0,0002) обнаружено при первично-прогредиентном течении РС, а также в стадии обострения (р=0,02 и р=0,01 соответственно) при ремиттирующей форме РС.

При ВПРС, как и при дебюте РС, не было отмечено значительного повышения ИСА с чёткой тенденцией к более частому выявлению ЭУс-а.

Стадия ремиссии РРС ассоциируется со снижением выявления как ЭУс-а, так и высоких показателей ИСА, и достоверных различий с нормой не имеет.

Следует отметить, что характер изменений ИСА и ЭУс-а при длительности заболевания более 10 лет и тяжести неврологического дефицита более 6,5 баллов имеет сходство со структурой аналогичных показателей в группе больных с ДНЗ. При этом отмечается наиболее выраженное и статистически значимое повышение лишь уровня мембранных адгезивных молекул. Можно предположить, что это сходство обусловлено выраженными дегенеративными, аксональными повреждениями у больных указанных групп.

Таким образом, установлена взаимосвязь показателей адгезии с характером течения РС, активностью процесса и, в меньшей степени, с тяжестью заболевания и его длительностью. Повышение показателей адгезии в дебюте и на ранних стадиях заболевания указывают на важную роль мембранных (мМА) и растворимых форм молекул адгезии (рМА) в инициации иммунопатологического процесса при РС, а при большой его длительности и тяжести заболевания - в его прогрессировании.

Исследование клеточной реактивности к основному белку миелина (ОБМ), туберкулоротеину (ТП), ганглиозидам мозга (ГМ) с помощью метода РППЛ При сопоставлении результатов исследования антигенреактивности клеток крови выявлено статистически значимое (р<0,01) повышение гиперчувствительности клеток крови больных РС ко всем использованным в работе антигенам: ОБМ, ГМ и ТП. В группе сравнения (ДНЗ) не выявлено повышения реактивности ни к одному из использованных нами антигенов (рис.3).

Обращает на себя внимание наиболее высокая в сравнении с другими подгруппами, гиперчувствительность к ОБМ у больных с дебютом РС и в ранние сроки заболевания. Наряду с этим, уже в дебюте РС у больных регистрируется значимая реактивность и к ГМ, и к ТП.

ОБМ ТП ГМ * + * + 40% 35% * + 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% РС Норма Группа сравнения (ДНЗ) * р<0,05 по сравнению с нормой + р<0,05 по сравнению с ДНЗ Рис.3. Показатели клеточной реактивности к ОБМ, ГМ ТП у больных РС Выявлена прямая взаимосвязь гиперчувствительности к ТП с реактивностью как к ОБМ, так и к ГМ. Это, по-видимому, может подтверждать расширение репертуара антигенов, участвующих в аутоиммунном процессе, в основе которого может лежать механизм перекрёстной реактивности. Состояние гиперчувствительности к ОБМ, ГМ и ТП обнаружено в подгруппах со ВПРС и РРС в период обострения заболевания.

В подгруппе ППРС отмечено значимое повышение реактивности лишь по отношению к ГМ. Для подгруппы РРС на стадии ремиссии не характерно повышение реактивности к исследованным антигенам, при этом ни в одном наблюдении не установлено положительного ответа на ТП. Из этого следует возможность практического применения РППЛ с ОБМ, ГМ, и, особенно ТП, в комплексе с другими параметрами для подтверждения стадий ремиссии и обострения при РРС.

Клеточная гиперчувствительность к ОБМ и ГМ была представлена в подгруппах больных с различной длительностью заболевания, начиная уже с первых лет развития, а также в сроки более 10 лет, что подтверждает роль ОБМ как в инициации аутоиммунного процесса, так и в развитии вторичного прогрессирования РС в поздние сроки. Клеточная реактивность к ТП наиболее часто выявлялась у больных с длительностью РС от 2 до лет (р=0,01), что, вероятно, связано с типом течения и активностью патологического процесса при РС.

У больных РС с неврологическим дефицитом более 6,5 баллов выявление реактивности к ОБМ и ТП несколько снижается, а гиперчувствительность к ГМ имеет тенденцию к нарастанию. Аналогичные тенденции прослеживаются и по мере увеличения длительности заболевания, что может отражать ослабление роли аутоиммунных проявлений и преобладание дегенеративных изменений.

Следует отметить, что реактивность к ГМ у больных ППРС и длительностью РС более 10 лет статистически не отличалась от группы больных ДНЗ, что может отражать прогредиентность течения и преобладание дегенеративных изменений у этих больных.

Определение субпопуляций лимфоцитов крови (фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+) и активированных клеток (CD25+, CD95+, HLADR+) при РС В группе больных РС в сравнении с группой доноров, выявлено достоверное повышение количества лейкоцитов (р=0,02), снижение процентного содержания Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-клеток (CD8+), а также абсолютного содержания субпопуляций CD25+ клеток, что подтверждает данные ряда авторов.

Выраженные изменения фенотипического состава лимфоцитов крови были выявлены нами в подгруппе больных с дебютом заболевания и при ремиттирующем течении РС. Следует отметить, что характерной только для дебюта РС была низкая экспрессия CD95+ фенотипа, маркера Fas- антигена (рис. 4). Мы полагаем, что активированные лимфоциты на стадии дебюта мигрируют в очаги поражения, однако этот процесс не сопровождается апоптозом иммунокомпетентных клеток периферической крови.

Рис. 4 Фенотипический состав лимфоцитов крови в дебюте РС * сравнение с нормой р<0, Характерным для дебюта РС является также разнонаправленность относительного (процентного) и абсолютного содержания Т клеток, субпопуляций СD4+, и в меньшей степени CD8+ клеток. В связи с развитием заболевания на фоне лейко- и лимфоцитоза, абсолютные значения этих субпопуляций у больных РС-д повышены, тогда как их относительное содержание снижено.

В период обострения РРС отмечается снижение относительного содержания CD8+ лимфоцитов (рис.5). В отличие от дебюта РС, отмечалось повышение содержания CD95+ клеток, маркёров апоптоза, кроме того, отмечается более выраженное (р=0,04), чем при других подтипах РС, снижение содержания CD25+ клеток крови.

Период ремиссии при РРС (рис.6) характеризуется возрастанием содержания основных субпопуляций, в том числе CD8+ клеток в сочетании со снижением количества В-лимфоцитов (CD20+) и наибольшим, по отношению к другим формам РС, увеличением экспрессии на лимфоцитах крови антигена CD95+. Мы полагаем, что такой характер изменений связан с элиминацией посредством апоптоза активированных лимфоцитов, то есть развитием так называемого «активационного» апоптоза.

* р<0,05 сравнение с нормой Рис.5 Фенотипический состав лимфоцитов крови при обострении РРС * р<0,05 сравнение с нормой Рис. 6 Фенотипический состав лимфоцитов крови при ремиссии РРС В подгруппах больных с прогредиентным течением заболевания выявлено снижение процентного содержания CD3+, CD4+, CD8+ при повышении их абсолютного количества при ППРС. Содержание В- лимфоцитов (CD20+), HLA-DR+ и экспрессия CD95+ имели тенденцию к повышению, что, по-видимому, отражает вялотекущий воспалительный аутоиммунный процесс.

Таким образом, выявлены изменения иммунограмм уже на стадии дебюта заболевания и при небольшой его длительности, и отмечены некоторые различия при прогредиентном и ремиттирующем течении болезни.

Изменения фенотипического состава лимфоцитов у больных РС в наибольшей степени были связаны с типом течения РС и активностью иммунопатологического процесса, и в меньшей степени с длительностью и тяжестью неврологического дефицита при РС.

Определение содержания иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM), иммунных комплексов, их фракционного состава (крупно-, средне- и мелко-молекулярной фракций) в сыворотке крови при РС.

В группе больных РС в целом, выявлено повышение содержания IgМ (р<0,001), общего количества ИК (р=0,02) и уровня мелкомолекулярной фракции ИК (р=0,03). При исследовании иммуноглобулинов и ИК при РС, выявлена взаимосвязь этих показателей с типом течения РС, активностью процесса, а также с тяжестью неврологического дефицита. Значительное повышение количества IgM обнаружено при всех типах РС, кроме РРС в стадии ремиссии. Отмечается значительное снижение уровня IgA при ППРС (р=0,02) и тенденция его к снижению в период ремиссии при РРС.

В дебюте РС повышение уровня IgM сочетается со статистически значимым повышением содержания IgG.

Содержание IgG прямо коррелировало с тяжестью течения РС, а также с уровнем IgM. Увеличение содержания IgM ассоциировалось с повышением мелкомолекулярной фракции ИК.

Отмечалось постепенное повышение содержания ИК и их фракций в зависимости от тяжести заболевания. В подгруппе больных со средней тяжестью заболевания отмечалось увеличение общего количества и мелкомолекулярной фракции ИК. При неврологическом дефиците более 6,баллов выявлено повышение как общего содержания ИК, так и максимальное повышение уровня всех фракций ИК.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»