WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Параллельно наблюдалось появление пиков, характерных для коньюгатов. Наличие нескольких пиков, соответствующих соединениям с высокими значениями молекулярной массы, означает, что в результате синтеза - 22 - образуется ряд коньюгатов с различным соотношением компонентов (фермент/антитело). Также следует отметить, что при наиболее низком значении концентрации окисляющего агента (8 мМ NaIO4) основной пик наблюдается для коньюгата с эквивалентным молекулярным соотношением ПС/антетело (время выхода 135 мин), в то время как при высоких концентрациях NaIO4 (32 и 40 мМ) основной пик наблюдается для коньюгатов с более высокой молекулярной массой (время выхода 80 минут).

Основываясь на полученных результатах, дальнейшая работа проводилась с использованием коньюгата ПС, синтезированного при концентрации 32 мМ NaIO4. В хИФА данный коньюгат сравнивали с аналогичным коньюгатом ПХ, синтезированным по стандартной методике при концентрации NaIO4, равной 17 мМ. Состав субстратной смеси, используемой для хемилюминесцентного детектирования в случае коньюгата ПС, был оптимизирован ранее (II.2.), в то время как для коньюгата на основе ПХ использовали стандартный состав субстратной смеси. Здесь ещё раз следует отметить, что для эффективного катализа реакции окисления люминола пероксидом водорода как для ПС, так и для других анионных пероксидаз, не требуется присутствия усилителей.

На рисунке 8. представлены результаты определения IgG мыши методом хИФА при использовании коньюгатов ПС и ПХ с антителами против IgG (a) (б) Рис. 8. Градуировочные графики определения концентрации IgG мыши «сэндвич»методом ИФА с хемилюминесцентным детектированием при использовании коньюгатов антител кролика против IgG мыши с пероксидазами сои (а) и хрена (б).

мыши. Для каждого опыта были проведены параллельные измерения (n=6), для холостых опытов было проведено 10 параллельных измерений.

Для нахождения аналитических характеристик определения IgG мыши была проведена статистическая обработка полученных результатов.

Статистические данные представлены в таблице 15.

- 23 - Таблица 15. Аналитические характеристики «сэндвич»-метода ИФА определения IgG мыши с хемилюминесцентным детектированием Пероксидаза Линейный диапазон, нг/мл Предел обнаружения, нг/мл Sr, % Время измерения 2 минуты ПС 25 10. 10 000 (R2 0.996) ПХ 25 11. 3 000 (R2 0.996) Время измерения 4 минуты ПС 25 11. 10 000 (R2 0.996) ПХ 25 11. 2 500 (R2 0.995) Время измерения 12 минут ПС 25 10. 10 000 (R2 0.996) ПХ 25 11. 2 000 (R2 0.993) Сравнение полученных параметров показало, что при применении коньюгата ПС значительно увеличивается линейный диапазон определяемых концентраций IgG мыши (100 10 000 нг/мл) по сравнению с коньюгатом ПХ (200 2 500 нг/мл), при этом значения предела обнаружения и относительного стандартного отклонения для обоих конъюгатов были одинаковыми (таб. 15.).

Увеличение линейного диапазона определяемых концентраций при определении IgG мыши с использованием коньюгата на основе ПС можно объяснить более высокой стабильностью ПС к радикальным продуктам окисления люминола. Данное явления было подробно описано в II.2. при изучении пероксидазного катализа окисления люминола пероксидом водорода и характерно для всех изученных анионных пероксидаз. Таким образом, пероксидаза в составе коньюгата сохраняет высокую стабильность, характерную для нативного фермента.

Особенно следует отметить стабильность хемилюминесцентного сигнала для коньюгата на основе пероксидазы сои. Как показано на рис. 4.4.4., вид градуировочного графика меняется для определения IgG мыши с течением времени. Однако, если в случае ПС наблюдается лишь незначительное падение интенсивности сигнала после 12 минут реакции окисления, а линейный диапазон определяемых концентраций сохраняет свои значения (100 – 10 мМ), то для ПХ интенсивность хемилюминесцентного уменьшается на порядок за тот же промежуток времени и происходит сокращение верхнего предела линейного диапазона с 3 000 до 2 000 мМ (табл. 15.). Ранее было показано, что ПХ инактивируется под действием образующихся радикальных продуктов окисления усилителей. Данное явление наиболее характерно при определении высоких концентраций определяемого вещества, а, следовательно, и концентрации пероксидазной метки. В итоге с течением времени такая высокая скорость снижения интенсивности излучения сигнала для высоких концентраций пероксидазной метки приводит к уменьшению линейного диапазона в области высоких концентраций (табл. 15.).

- 24 - ВЫВОДЫ 1. Используя кожуру клубней батата (Ipomoea batatas) была выделена до гомогенного состояния анионная пероксидаза. Очистка пероксидазы проводилась включала следующие стадии: гомогенизация, экстракция пигментов с помощью 2-х-фазной системы, включающей полиэтиленгликоль и сульфат аммония, гидрофобную хроматография на Фенил-сефарозе и ионнообменную хроматографию на ДЭАЭ-тоеперле.

Чистота препарата была подтверждена с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях и изоэлектрофокусированием.

2. Молекулярная масса и изоэлектрическая точка пероксидазы батата равны 37000 Да и 3.5 соответственно; удельная активность, измеренная в отношении гваякола, - 4900 ед/мг белка. Электронный спектр пероксидазы батата совпадал с типичным спектром гем-содержащих пероксидаз растений. Показано, что субстратная специфичность пероксидазы батата, изученная в отношении феруловой кислоты, гваякола, о-фенилендиамина, о-дианизидина, 2,2'-азино-бис(3этилбензотиазолин-6-сульфоната) аммония и пирокатехина, отлична от субстратной специфичности других пероксидаз растений.

3. Изучено влияние условий проведения реакции (рН и концентрации реагирующих соединений и буфера) окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазами пальмы, батата и сои, на интенсивность хемилюминесценции. Показано, что максимальная хемилюминесценция регистрируется при рН 8.3, 8.4 и 7.8 в случае использования пероксидазы пальмы, сои и батата соответственно.

Продемонстрировано, что эффективность катализа исследованных анионных пероксидаз практически не зависит от наличия в реакционной среде «усилителей» (4-иодфенола и 4-гидроксикоричной кислоты).

Предел чувствительности определения пероксидаз пальмы, сои и батата по реакции окисления люминола пероксидом водорода составил 1 пМ, 0.пМ и 0.01 пМ, соответственно. Особенностью анионных пероксидаз растений является стабильность производимого ими при окислении люминола хемилюминесцентного сигнала, что позволяет говорить о перспективности применения этих новых ферментов в аналитической практике.

4. Показано, что комплексы рутения(II) с общей формулой [RuII(C~N)(N~N)2]PF6, где C~N = 2-фенилпиридин или 2-(4’толил)пиридин, а N~N = 2,2’-бипиридин, 1,10-фенантролин или 4,4’диметил-2,2’-бипиридин, легко окисляются H2O2 в присутствии пероксидаз пальмы, батата и хрена. Все ферменты окисляют изученные комплексы рутения с одинаковой эффективностью. Найдено, что синтезированные рутенивые комплексы являются прекрасными - 25 - метиаторами в пероксидазном катализе «плохих» субстратов, что было показано на примере изучения реакции окисления пирокатехина.

5. Изучены пероксидазы пальмы, хрена и батата, как активные компоненты ферментных электродов с прямым и медиаторным переносом электронов.

Показано, что биосенсоры для определения Н2О2 на основе пероксидазы пальмы обладали наиболее высокой чувствительностью, более широким рабочим диапазоном и повышенной операционной стабильностью и стабильностью при хранении. Исследования по рН-зависимости сигнала биосенсоров продемонстрировали, что электроды, модифицированные пероксидазой пальмы, сохраняют способность детектировать Н2О2 при кислых условиях (рН 3-4). Найдено, что конструирование ферментных электродов с медиаторным переносом электронов приводит к значительному увеличению чувствительности и стабильности биосенсоров для всех изученных пероксидаз.

6. На основе пероксидазы пальмы/хрена и алкогольоксидазы конструированы двухслоиные биферментные биосенсоры для определения этанола. При создании чувствительного слоя биосенсора ферменты разного типа включались в разные слои электропроводящих полимеров. Сравнение биферментных биосенсоров на основе пероксидазы пальмы показало преимущество перед пероксидазой хрена:

более высокая чувствительность, более широкий линейный диапазон определяемых концентраций этанола, большая операционная стабильность. Полученные биосенсоры протестированы для контроля качества вина. Результаты биоэлектрохимического анализа для реальных образцов вина показали хорошую корреляцию с спектрофотометрическим и рефрактометрическим методами, используемыми в настоящее время в виноделии.

7. Оптимизирован периодатный метод синтеза иммуноконъюгата пероксидазы сои и антител против иммуноглобулина G мыши. На примере разработанной тест-системы для определения IgG мыши продемонстрирована перспективность использования анионной пероксидазы сои в ИФА с хемилюминесцентной детекцией как ферментного маркера. Сравнения конъюгатов используемых антител с пероксидазами сои и хрена показало, что в случае пероксидазы сои в условиях реального анализа затухание образующегося хемилюменесцентного сигнала протекало значительно медленней.

Применение конъюгата с пероксидазой сои позволило повысить чувствительность и рабочий диапозон изучаемой тест-системы.

- 26 - СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1) Leon J.C., Alpeeva I.S., Chubar T.A., et al., Purification and substrate specificity of peroxidase from sweet potato tubers, Plant Science, 2002, (5), 1011-1019.

2) Alpeeva I.S., Soukharev V.S., Alexandrova L., et al., Cyclometalated ruthenium(II) complexes as efficient redox mediators in peroxidase catalysis, Journal of biological inorganic chemistry, 2003, 8 (6), 683-688.

3) Alpeeva I.S., Sakharov I.Y., Soybean peroxidase-catalyzed oxidation of luminol by hydrogen peroxide, Journal of agricultural and food chemistry, 2005, 53 (14), 5784-5788.

4) Alpeeva I.S., Niculescu-Nistor M., Leon J.C., et al. Palm tree peroxidasebased biosensor with unique characteristics for hydrogen peroxide monitoring, Biosensors and Bioelectronics, 2005, 21(5), 742-748.

5) Alpeeva I.S., Vilkanauskyte A., Ngounou B., et al. Bi-enzyme alcohol biosensors based on genetically engineered alcohol oxidase and different peroxidases, Microchimica Acta, 2005, 152 (1-2), 21-27.

6) Алпеева И.С., Сахаров И.Ю., Окисление люминола, катализируемое пероксидазой, выделенной из листьев королевской пальмы, Приклодная биохимия и микробиология, 2007, 43 (1), 31-35.

7) Sakharov I.Y., Alpeeva I.S., Efremov E.E., Use of soybean peroxidase in chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay, Journal of agricultural and food chemistry, 2006, 54 (5), 1584-1587.

8) Alpeeva I.S., Sakharov I.Y., Lumonol-hydrogen perpxide chemiluminescence produced by sweet potato peroxidase, Luminescence, 2006, 21, in print (available online: www.interscience.wiley.com DOI: 10.1002/bio.931).

9) Sakharov I.Yu., Vesga B.M.K., Bovin N.V., Roig M.G., Sakharova I.V., Alpeeva I.S., Bautista A.G. Isolation and some properties of thermostable peroxidase from royal palm tree leaves. Proc. Internal.Conf. Biocatalysis2000, 10-15 June, Moscow, Russia, p.10) Alpeeva I.S., Alexandrova L., Gazaryan I.G., Ryabov A., Sakharov I.Yu.

Ruthenium-Organic Complexes are Efficient Redox Mediators of Plant Peroxidases. Proc. Intern.conf. Biocatalysis-2002, June 22-27, 2002, Moscow, Russia, p.66-11) Alpeeva I.S., Alexandrova L., Gazaryan I.G., Ryabov A., Sakharov I.Yu.

Cyclometalated Ruthenium (II) Complexes As Efficient Redox Mediators in Peroxidase Catalysis. Proc. VI Intern. Plant Peroxidase Symp., Murcia, Spain, July3-7, 2002, S2-P12) Alpeeva I.S., Castillo Leon J., Chubar T.A., Galaev I.Yu., Csoregi E., Sakharov I.Yu. Purification and substrate specificity of peroxidase from sweet potato tubers Proc. VI Intern. Sym. Biotechnology– state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, October 14 -18, 2002, С.6.13) Alpeeva I.S., Nistor M., Castillo Leon J., Csoregi E., Sakharov I.Yu.

Biosensors for determination of hydrogen peroxide with improved parameters based on palm tree peroxidase. Proc. VII Intern. Sym. Biotechnology– state of - 27 - the art and prospects of development, Moscow, Russia, November 10 -14, 2003, v.2, p.194-14) Alpeeva I.S., Niculescu-Nistor M., Castillo Leon J., Csоregi E., Sakharov I.Yu. Palm tree peroxidase-based biosensor with unique characteristics for hydrogen peroxide and glucose monitoring. Proc. 18 Intern. Symp. On Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 14-19 June 2005, Coimbra, Portugal, P-15) Берлина А.Н., Алпеева И.С., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б., Сахаров И.Ю.

Иммуноферментный анализ сульфаметоксипиридазина с помощью биотин/стрептавидиновой пары. Труды междунар. конф. Биотехнология и медицина, Москва, Россия, 14-17 марта 2006, р. 16) Alpeeva I.S., Berlina A.N., Zherdev A.V., Efremov E.E., Dzantiev B.B., Sakharov I.Yu. Advantages of application of anionic soybean peroxidase in chemiluminescent ELISA. Proc. Intern.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»