WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

(1 – 700 мМ), чем биосенсоры на основе катионной ПХ (10 – 200 мМ) и другой анионной пероксидазы ПБ (10 – 200 мМ) Сравнительное изучение инактивации ПХ, ПП и ПБ по отношению к пероксиду водорода позволило объяснить Табл. 9. Инактивация растительных пероксидаз в причину того, что для присутствии H2Oбиосенсоров на основе kinac 103 (мин-1) ПП наблюдается более [H2O2], мМ ПП ПБ ПХ широкий линейный 0 мМ 0 0 диапазон, чем в случае 0.2 мМ 1.3 ± 0.1 1.6 ± 0.других биосенсоров.

2 мМ 0.4 ± 0.05 4.0 ± 0.2 3.8 ± 0.Как видно из табл. 9, ПП 20 мМ 0.7 ± 0.05 15.0 ± 0.3 5.6 ± 0.не инактивируется в присутствии 0.2 мМ пероксида водорода в нейтральных условиях. Повышение концентрации пероксида водорода до 20 мМ позволяет обнаружить инактивацию ПП, однако константа скорости инактивации принимала очень низкое значение. В случае же двух других пероксидах (ПХ, ПБ) специфическая активность напротив значительно понижалась при воздействии на них пероксида водорода.

- 15 - I, нА Таким образом, более высокая стабильность ПП в присутствии пероксида водорода является ключевым моментом, позволяющим измерять концентрацию пероксида водорода вплоть до мкМ при использовании биосенсоров на основе ПП (табл.

10.).

Более высокая кислотостабильность ПП даёт возможность использования биосенсоров на основе ПП в кислых условиях, которые часто используются в пищевых процессах (табл. 10.).

0 1000 2000 3000 4000 [H2O2], мМ Для сравнения для Рис. 4. Градуировочные графики, полученные с биосенсоров на основе ПХ, ПП и помощью биосенсоров на основе ПП (сплошная ПБ были получены линия), ПХ (пунктирная линия), ПБ (штриховая линия). Экспериментальные условия: проточноградуировочные графики по инжекционная система, приложенный пероксиду водорода при кислых потенциал –50 мВ, скорость потока 0.5 мл/мин, условиях (рН 4.5) (рис. 4). Из 0.1 М фосфатный буфер, рН 4.5.

полученных результатов видно, что при понижении рН с 6 до 4.5 чувствительность биосенсоров на основе ПХ и ПБ заметно снижается, в то время как в случае биосенсоров на основе ПП градуировочные графики при обоих значениях рН были одинаковы и, следовательно, высокое значение чувствительности сохраняется и при кислом значении рН. Таким образом, биосенсоры на основе ПП демострируют уникальную возможность определения пероксида водорода в кислых и нейтральных условиях с одинаковой эффективностью.

Табл. 10. Биоэлектрохимические параметры биосенсоров на основе ПП, ПХ и ПБ с прямым переносом электронов pH 6.0 pH 4.Чувствитель- Линейный Чувствитель- Линейный ность2, диапазон, ность2, диапазон, нА*мкМ-1*см-2 мкМ нА*мкМ-1*см-2 мкМ ПП 53 1 700 1 ПХ 49 10 200 10 ПБ 10 10 200 10 Для практического применения ферментных электродов особое внимание следует уделять повышению операционной стабильности сенсора.

- 16 - I, нА Стабильность биосенсора главным образом определяется стабильностью используемого фермента.

Сравнение операционной стабильности биосенсоров на основе ПХ, ПП и ПБ проводили путем пропускания через электролитическую ячейку раствора субстрата в течение длительного времени. При этих условиях сигнал биосенсора на основе ПП снижается лишь до 90%, в то время как для ПБ и ПХ ответ снижался до 30 и 45% от первоначального, соответственно.

Также была протестирована стабильность при хранении пероксидазных электродов, которые между измерениями хранились при + 4 °С. После семи дней хранения для биосенсоров на основе ПХ и ПБ наблюдалось лишь 27 и 22% от первоначального значения ответа (по току), тогда как для биосенсоров на основе ПП не наблюдалось какого-либо значительного снижения сигнала по отношению к 0.1 мМ H2O2 за весь период.

II.3.2. Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе анионных пероксидаз с медиаторным переносом электронов В настоящее время описан ряд биосенсоров с применением ПХ на основе медиаторного переноса электронов. В нашей работе иммобилизацию пероксидазы (ПХ, ПП, ПБ) на поверхности электрода проводили ГЕЛЬ путем формирования слоя гидрогеля с включенными молекулами фермента, Схема 1. Взаимодействие комплекса Os, модифицированного полученный в ПВИ, с концевыми NH2-группами пероксидазы и бифункцианального сшивающего агента ПЭГДГЭ результате обработки редокс полимера (ПВИ10-Os) и пероксидазы бифункциональным сшивающим агентом (ПЭГДГЭ) (сх. 1). С использованием оптимизированных по составу биосенсоров были построены градуировочные графики по пероксиду водорода (рис. 5.) и рассчитаны основные параметры биосенсоров (табл. 11.).

- 17 - Сравнение полученных данных показало, что биосенсоры на основе ПП и ПХ демонстрируют наибольший линейный диапазон определяемых концентраций пероксида водорода, который составил 10 – 5 000 мМ. В случае ПХ и ПБ линейный диапазон был уже и его значение составило 10 – 4 000 мМ и 10 – 1 000 мМ соответственно. Более значительные отличия наблюдались в чувствительности изученных биосенсоров. Так, чувствительность Рис. 5. Градуировочные графики по пероксиду биосенсоров на основе ПП водорода, полученные с помощью биосенсоров на основе медиаторного переноса электронов: ПП практически в 1.5 раза (сплошная линия), ПХ (пунктирная линия), ПБ превышала аналогичные (штрих-пунктирная линия). Экспериментальные параметры для ПХ и ПБ.

условия: проточно-инжекционная система, приложенный потенциал –50 мВ, скорость потока 0.Данные, полученные в случае мл/мин, 0.1 М фосфатный буфер, рН 6.0.

медиаторного переноса электронов, хорошо коррелируют с данными в случае прямого переноса электронов (II.3.1.), что свидетельствует о том, что при иммобилизации исследованные пероксидазы сохранили свои каталитические свойства. Особенно следует отметить, что использование медиатора привело к значительному увеличению значения линейного диапазона определяемых концентраций пероксида водорода в сторону увеличения концентрации для всех представленных пероксидаз.

Табл. 11. Биоэлектрохимические параметры биосенсоров на основе ПП, ПХ и ПБ с медиаторным переносом электронов Тип биосенсора Чувствительность, Линейный диапазон, нА*мM-1см-2 мкM ПП/ПГЭДГЭ/ПВИ10Os (45.35%/11.33%/43.32% (по весу)) ПХ/ ПГЭДГЭ/ПВИ10Os (22.67%/11.33%/65.99% (по весу)) ПБ/ ПГЭДГЭ/ПВИ10Os (29.41%/22.59%/48.0% (по весу)) Кроме того, иммобилизация в редокс геле привела к ожидаемому увеличению операционной стабильности и стабильности при хранении биосенсоров для всех изученных пероксидаз. Как и в случае адсорбции на - 18 - поверхности электрода, наибольшая стабильность полученных биосенсоров наблюдалась для ПП.

II.3.3. Биферменты биосенсоры на основе анионных пероксидаз и алкогольоксидазы В последнее время разработано большое количество различных биосенсоров для определения этанола, главным образом, при использовании алкогольоксидазы (AO). Зачастую, однако, низкая стабильность полученных сенсоров является основным фактором, ограничивающим их практическое применение. Таким образом, в настоящее время остается актуальным вопрос о создании биосенсора для определения этанола с улучшенными характеристиками (высокая чувствительность, быстрый ответ, стабильность).

Оптимальный перенос электронов между иммобилизированной в редоксгидрогеле пероксидазой оказывается возможным только в том случае, когда этот слой не содержит АО, которая вероятно повышает среднее расстояние Рис. 6. Градуировочные графики, полученные с между редокс-полимером и помощью биферментных биосенсоров на основе пероксидазой. Поэтому был ПП (сплошная линия), ПХ (пунктирная линия).

сконструирован двух-слойный Экспериментальные условия: проточнобиосенсор, где первый слой инжекционная система, приложенный потенциал –50 мВ, скорость потока 0.5 мл/мин, 0.1 М содержал пероксидазу (ПХ или фосфатный буфер, рН 6.0.

ПП), иммобилизированную в редокс гидрогеле, модифицированном комплексом Os, а второй слой был создан электрополимеризацией катодного полимера КП5 с одновременным включением в структуру АО.

После оптимизации состава биферментных биосенсоров были получены градуировочные графики по этанолу (рис. 6.) и рассчитаны основные биоэлектрохимические параметры (табл. 12.). Значения Км схожи для двух типов биосенсоров и значительно превышали значение Км, полученного для АО в растворе (2.7 мМ). Это указывает на затрудненную диффузию этанола сквозь слой осажденного КП5. Подобное явление наблюдалось также для биосенсоров в отсутствии второго слоя при определении пероксида водорода.

Значение предела обнаружения (величина, превышающая в три раза соотношение сигнал/шум) было равным 0,02 мМ для обоих типов биосенсоров.

- 19 - Разработанные биосенсоры демонстрировали достаточно высокую воспроизводимость сигнала по току (Sr 5-10%, n = 3).

Табл. 12. Биоэлектрохимические параметры биосенсоров на основе алкогольоксидазы и пероксидазы (ПП, ПХ) Тип Imax, нА Km, мМ Линейный Предел Чувствиибиосенсо диапазон, обнаружения, тельность, ра мМ мМ нА*мМ-1*см-60 0.572 ± 7 9.6 ± 0.3 1 ПХ/АО 98 0.940 ± 15 9.6 ± 0.5 1 ПП/АО Для оценки операционной стабильности оптимизированных биферментных биосенсоров, они были интегрированы в автоматический инжекционный анализатор, позволяющий многократно впрыскивать образцы этанола с объемом 100 мкл и концентрацией 5 мМ.

Для определения операционной стабильности биосенсоров для анализа этанола в качестве образцов были использованы также образцы вина.

Полученные константы инактивации демонстрируют, что стабильность биосенсоров в разбавленных образцах вина была несколько ниже, чем стабильность в водном растворе этанола.

Табл. 13. Константы инактивации биферментных биосенсоров в растворе kinact, мин-ПЕРОКСИДАЗА Раствор этанола в буфере Образец вина, разбавленный буфером ПС 0.00016 0.ПХ 0.00017 0.Полученные биосенсоры были использованы для определения этанола в образцах вин, содержание этанола в которых достигало 18%. Для анализа, проводимого методом добавок, использовались разведенные буфером в раз образцы вина. Данные по определению концентрации этанола в вине представлены в таблице 14. Результаты, полученные с помощью биосенсоров, демонстрируют хорошую корреляцию с другими методами.

- 20 - Табл. 14. Определение этанола в образцах вин различными методами [EtOH], M Образец вина Метод добавочных Метод добавочных Спектрофото- Концентрация, стандартов при стандартов при метрический заявленная использовании использовании метод при производителем биферментных биферментных использовании (рефрактометрический биосенсоров на основе ПП биосенсоров на основе PQQ-АДГ метод) ПХ Каберне Совиньон 1.945 1.948 2.023 1.(красное вино) Херес 3.200 3.199 3.080 3.(крепленое белое вино) Шардоне 1.890 1.865 1.878 1.(белое вино) III. Применение анионных пероксидаз в иммуноферментном анализе на примере пероксидазы сои Как было показано выше (II.2.), анионные пероксидазы растений, катализируя окисления люминола пероксидом водорода, продуцируют стабильный длительный во времени хемилюминесцентный сигнал.

Обнаруженный эффект послужил основание для использования анионных пероксидаз в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией.

Так как для синтеза иммуноконъюгатов с пероксидазой требуются препаративные количества фермента, в данной работе нами была использована пероксидаза сои, которая является коммерчески доступной. Как обычно, в качестве фермента сравнения была использована пероксидаза хрена (изофермент с).

В качестве модельной тест-системы был выбран «сэндвич» ИФА для определения IgG мыши. В «сэндвич» системе используются антитела, иммобилизированные на поверхности планшета, и антитела, меченных ферментом. Эта система является одной из наиболее распространенных для анализа поливалентных антигенов, таких как, например, иммуноглобулины класса G.

Выбор данной тест-ситемы объясняется доступностью иммунореагентов.

Однако следует учесть также тот факт, что определение IgG имеет также практическое значение в связи с тем, что существует множество иммунологических наборов, включающих в качестве активного компонента моноклональные антитела мыши, и, соответственно, требующего их количественного определения.

Для синтеза коньюгатов пероксидазы с антителами использовали периодатный метод. В основе этого метода лежит окисление углеводных цепочек пероксидазы NaIO4 с образованием альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами молекулы антитела или антигена. Данная реакция - 21 - широко используется на практике для получения коньюгатов ПХ с антителами или антигенами.

Хорошо известно, что степень гликозилирования ПХ и ПС различна, а также наблюдаются существенные различия в составе и локализации углеводной части. Поскольку совокупность данных параметров сильно влияет на свойства пероксидаз, в первую очередь были оптимизированы условия окисления ПС. Следует отметить, что ранее такие исследования не проводились.

При оптимизации условий окисления ПС варьировали концентрацию окислителя (NaIO4) в реакционной среде в интервале от 8 до 40 мМ.

Полученные окисленные формы ПС реагировали с очищенными антителами, полученными при иммунизации кроликов IgG мыши. Эффективность синтезированных коньюгатов сравнивали, используя «сэндвич» ИФА c колориметрическим детектированием активности пероксидазы. На рис. 7.

видно, что наибольшую активность проявляет коньюгат, синтезированный при использовании раствора NaIO4 с концентрацией мМ. Интересно отметить, что оптимальная концентрация NaIO4 в случае ПС значительно выше, чем используемая в случае ПХ (17 мМ).

Рис. 7. Кривые разведения коньюгатов пероксидазы сои с антителами кролика против IgG мыши, Рис. 7. наглядно синтезированные при использовании раствора окислителя с различной концентрацией NaIO4, демонстрирует, что получены методом ИФА со активность коньюгатов ПС с спектрофотометрическим детектированием.

антителами против IgG мыши, полученных при различных концентрациях NaIO4, была не одинаковая.

Для выяснения причин такого явления была проводена гельфильтрация полученных коньюгатов на Суперозе 12. Сравнение хроматограмм коньюгатов, синтезированных при различной концентрации NaIO4, показывает, что увеличение концентрации окисляющего агента приводит к уменьшению площади пика, характерного для несвязанной формы ПС. Это означает, что выход коньюгата напрямую зависит от концентрации окисляющего агента.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»