WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Величины kэфф, характеризующие эффективность ферментативного окисления изучаемых субстратов в присутствие ПБ, приведены в табл. 3. Как хорошо видно, наиболее «медленными» субстратами являются пирокатехин и гваякол, производные фенола. Такие соединения, как о-дианизидин и офенилендиамин (ароматические амины), окисляются пероксидом водорода в присутствие ПБ значительно быстрее. Однако наилучшими субстратами для ПБ оказались АБТС и феруловая кислота. Если в случае АБТС (синтетического субстрата) высокое значение kэфф имеет исключительно прикладное значение, то в случае феруловой кислоты высокое значение константы kэфф позволяет предположить, что анионная ПБ в условиях in vivo активно участвует в процессах лигнификации.

Сравнение значений kэфф, полученных для пероксидаз ПБ и ПП, показало, что ПП по отношению к большинству субстратов является более эффективным биокатализатором. Сопоставление же субстратной специфичности анионных ПБ, ПП, ПС и пероксидаз из других растений (табл.

3.) показало их каталитическую уникальность, что в сочетании с отмеченной ранее высокой стабильностью, как в случае ПП, так и ПС, создает отличные перспективы для их практического использования.

- 8 - Табл. 3. Субстратная специфичность некоторых растительных пероксидаз Субстраты kэфф x 106 (M-1с-1) Источник пероксидазы батат пальма соя хрен табак арахис люцерна АБТС 3.5 52.0 0.36 4.0 1.1 0.37 1.феруловая к-та 27.0 63.0 - - - - - o-дианизидин 0.7 1.0 0.39 4.3 2.0 2.0 2.o-фенилендиамин 1.2 2.9 0.04 0.49 0.03 0.22 0.гваякол 0.5 1.2 0.64 1.6 0.51 2.4 15.пирокатехин 0.1 0.23 - - - - - II.2. Изучение реакции окисления металлоорганических комплексов рутения в присутствии анионных пероксидаз и их медиаторных свойств Как было показано в II.1., для пероксидаз существуют субстраты с низкими константами скорости окисления. Однако иногда технологическая необходимость требует ускорения протекания таких реакций. В связи с этим последнее время наблюдается повышенный интерес к изучению металлоорганических комплексов на основе рутения и осмия, некоторые из которых уже успешно применяются в качестве медиаторов при конструировании ферментативных биосенсоров. Принципиально новыми в ряду соединений такого рода являются рутениевые комплексы с ковалентной связью углерод – рутений. Ожидается, что такие комплексы будут хорошими субстратами пероксидаз и обладать высокой медиаторной активностью.

Были исследованы пять новых металлоорганических комплексов рутения (табл. 4.). При этом была использована методология, разработанная и примененная нами при изучении субстратной специфичности ПБ.

Первоначально была предпринята попытка оптимизировать условия ферментативного окисления рутениевых комплексов пероксидом водорода в присутствии анионных ПП и ПБ и катионной ПХ.

Cравнение оптимальных условий окисления рутениевых комплексов перексидом водорода в присутствии ПП, ПБ и ПХ (табл. 4.) показывает значительные отличия в оптимальных значениях концентрации окислителя.

Так, в случае анионных ПП и ПБ максимальная ферментативная активность наблюдалась при концентрации пероксида водорода, равной 0,12 и 0,8 мМ, соответственно, то в случае катионной ПХ это значение было заметно выше и составило 3.3 мМ.

При определенных оптимальных условиях (табл. 4.) были оценены значения эффективной константы второго прядка kэфф, характеризующие эффективность рутениевых комплексов как субстратов ПП, ПБ и ПХ.

Результаты приведены в табл. 5.

- 9 - Полученные данные демонстрируют, что все пять представленных рутениевых комплекса окисляются в присутствии каждой из пероксидаз (ПП, ПБ и ПХ) с примерно одинаковыми скоростями. Однако, если сравнивать данные по трем пероксидазам, то можно отметить, что если для ПП и ПХ значения kэфф были равны 1.0-2.7 х 107 М-1с-1, то в случае ПБ аналогичные значения было на порядок ниже для всех изученных комплексов.

Табл. 4. Оптимальные условия ферментативного окисления рутениевых комплексов в присутствии анионных пероксидаз ПХ ПБ ПП [H2O2], [S], р [Буфер], [H2O2], [S], рН [Буфер], [H2O2], [S], рН [Буфер], Рутениевые комплексы мМ мМ Н мМ мМ мМ мМ мМ мМ мМ [Ru(phpy)(bpy)2]PF6 3.3 0.1 4.5 10 0.82 0.1 4.5 10 0.12 0.1 4.5 [Ru(phpy)(phen)2]PF6 3.3 0.1 4.5 10 0.82 0.1 4.5 10 0.12 0.1 4.5 [Ru(phpy)(Me2bpy)2]PF6 3.3 0.1 4.5 10 0.82 0.1 4.5 10 0.12 0.1 4.5 [Ru(topy)(bpy)2]PF6 3.3 0.1 4.5 10 0.82 0.1 4.5 10 0.12 0.1 4.5 [Ru(topy)(phen)2]PF6 3.3 0.1 4.5 10 0.82 0.1 4.5 10 0.12 0.1 4.5 Табл. 5. Эффективная константа скорости окисления рутениевых комплексов для трех пероксидаз растений kэфф, М-1с-Комплекс ПХ ПБ ПП [Ru(phpy)(bpy)2]PF6 2.4 х 107 3.1 х 106 1.0 х [Ru(phpy)(phen)2]PF6 2.7 х 107 7.0 х 106 1.6 х [Ru(phpy)(Me2bpy)2]PF6 2.0 х 107 5.3 х 106 1.3 х [Ru(topy)(bpy)2]PF6 1.4 х 107 6.0 х 106 2.0 х [Ru(topy)(phen)2]PF6 1.0 х 107 1.9 х 106 1.4 х Сравнение полученных значений констант скоростей окисления рутениевых комплексов с данными по окислению традиционно используемых субстратов для ПП, ПБ и ПХ (табл. 3.) позволяет сделать вывод о том, что рутениевые комплексы являются «хорошими» субстратами исследуемых пероксидаз.

Высокие значения констант kэфф позволили предположить, что рутениевые комплексы могут быть использованы как медиаторы в реакции окисления некоторых ароматических субстратов в присутствии пероксидазы.

Как упоминалось выше, реакции окисления некоторых ароматических аминов и фенолов протекают с низкой скоростью, т. е. являются «плохими» субстратами пероксидаз. Процесс можно ускорить, используя медиаторы – вещества, которые окисляются пероксидазой с большими скоростями и затем могут регенерировать, передавая полученный окислительный потенциал на «плохой» субстрат. Затем этот комплекс может снова участвовать в следующем ферментативном цикле. Учитывая выше сказанное, схема взаимодействия выглядит следующим образом:

- 10 - E + H2O ЕI + H2O k ЕI + Mred ЕII + Mox k ЕII + Mred E + Mox k Mox + S Mred + P kc, где E, ЕI и ЕII – пероксидаза и ее окисленные формы, Mred, Mox – восстановленная и окисленная форма медиатора, S – «плохой» субстрат пероксидазы, P – продукты реакции.

Так как значения констант скорости окисления для всех комплексов подобны (табл. 5.), для дальнейшего анализа был выбран [Ru(phpy)(bpy)2]PF6. В качестве субстрата с низким значение kэфф был выбран пирокатехин (табл. 3.), часто используемый как модельный субстрат пероксидаз.

Поскольку добавление рутениевых комплексов сильно увеличивает поглощение при длине волны 295 нм (максимум поглощения продуктов окисления пирокатехина), за изменением концентрации пирокатехина в процессе реакции наблюдали методом ВЭЖХ.

Табл. 6. Кинетические параметры реакции ферментативного окисления пирокатехина перекисью водорода РЕАКЦИЯ k, M-1c-1.1 x 10-пирокатехин + Н2О9.0 x 10-пирокатехин + [Ru2+(phpy)(bpy)2]PF6 + Н2О Е 3.1 x [Ru2+(phpy)(bpy)2]PF6 + Н2О [Ru3+(phpy)(bpy)2]PF6 + пирокатехин 0.75 ± 0.По площадям хроматографических пиков, полученным в различные моменты времени, были определены эффективные константы ферментативного окисления пирокатехина Н2О2 в присутствии и отсутствии рутениевого комплекса (табл. 6.), которые составили 5.0 х 106 М-1с-1 и 1.1 х 102 М-1с-соответственно.

Следует отметить, что величина kэфф пирокатехина, определенная в условиях данного эксперимента, несколько ниже kэфф пирокатехина, определенной в оптимальных условиях окисления пирокатехина. Это вызвано несколькими причинами: во-первых, введение детергента (ЦТАВ) в реакционную среду, добавленного для увеличения растворимости и стабильности при низких значениях рН рутениевых комплексов, снижает эффективность катализа пероксидазы; во-вторых, процесс исследовался при оптимальных условиях для окисления рутениевых комплексов, которые достаточно сильно отличаются от оптимальных условий окисления пирокатехина.

- 11 - В любом случае, значение kэфф реакции окисления пирокатехина в присутствии медиатора превышает значение kэфф в его отсутствии, при оптимальных условиях окисления пирокатехина, более чем в 50 раз (табл. 6.).

II.3. Изучение реакции окисления люминола в присутствии анионных пероксидаз Поскольку в настоящее время пероксидазы широко используются в качестве метки в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией, где применяется реакция окисления люминола пероксидом водорода, в рамках работы по исследованию субстратной специфичности анионных пероксидаз была изучена реакция окисления люминола в присутствии ПП, ПБ и ПС. В качестве окислителя использовался пероксид водорода, а активность пероксидаз оценивалась по интенсивности образующегося сигнала хемилюминесценции.

Как и на предыдущих этапах работы, вначале были подобраны оптимальные условия катализа для изучаемых ферментов (табл. 7.).

Табл. 7. Оптимальные условия окисления люминола в присутствии пероксидаз растений Условия ПП ПБ ПС ПХ рН 8.2 7.8 8.3 8.[Н2О2], мМ 4-8 4-6 6 - 10 2.[ЛЮМИНОЛ], мМ 6-10 8-10 4 - 10 1.[БУФЕР], мМ 30 100 100 Для эффективного окисления люминола в присутствии ПХ требуется введение в реакционную смесь, называемых “усилителями”. Классическим “усилителем” для ПХ является р-иодфенол. В случае анионных пероксидаз эффект р-иодфенола был крайне невелик.

В табл. 8. представлены основные данные зависимости интенсивности люминесценции от концентрации пероксидазы. Из полученных данных видно, что линейная зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации пероксидазы наблюдается в диапазоне концентраций: 0.2 – 2.пМ для ПБ, 10 – 180 пМ для ПП и 10-100 пМ для ПС. Величина предела обнаружения пероксидазы была определена как концентрация фермента, в присутствие которого наблюдается интенсивность хемилюминесценции, втрое превышающей интенсивность фоновой реакции. В случае ПП, ПБ и ПС предел обнаружения составил 1.0 пМ, 0.01 пМ и 0.3 пМ соответственно. Следует отметить уникально низкое значение предела обнаружения для ПБ.

- 12 - Табл. 8. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации анионных пероксидаз Линейный диапазон Предел обнаружения, пМ определяемых кон-ций, пМ ПП 10 – 180 1,ПБ 0,2 – 2,0 0,ПС 10 – 100 0,На рис. 1. представлены типичные кинетические кривые окисления люминола пероксидом водорода в присутствие ПП различных пероксидаз. Как 80 ПС хорошо видно, все ПБ приведенные кривые имеют различный характер. Так, в случае реакции усиленной хемилюминесценции, наблюдаемой в присутствии ПХ, на первом этапе 0 50 100 Время, мин интенсивность быстро Рис. 1. Типичные кинетические кривые достигает своего изменения интенсивности свечения в процессе максимального значения, а окисления люминола перекисью водорода в затем также быстро присутствии ПХ, ПП, ПС и ПБ.

уменьшается. Падение интенсивности хемилюминесценции связано с инактивацией ПХ продуктами реакции окисления усилителей и люминола.

В отличие от ПХ, интенсивность свечения в реакции окисления люминола при использовании анионных пероксидаз (ПП, ПБ и ПС), хотя и нарастала несколько медленней, но, достигнув своего максимального значения, на протяжения длительного периода времени не изменялась. Данное явление, по-видимому, можно объяснить большей стабильностью анионных пероксидаз к воздействию радикальных продуктов реакции окисления люминола, что косвенно подтверждается данными по устойчивости ПП к радиационному облучению.

На основании полученных результатов можно говорить о перспективности использования анионных пероксидаз пальмы, батата и сои в иммуноферментном анализе в формате с хемилюминесцентной детекцией ферментативной активности. Так, все изученные в рамках данной работы анионные пероксидазы стабильны к продуктам реакции, что обеспечивает высокий стабильный сигнал на протяжении длительного времени. Особенно следует отметить, что для получения высокого хемилюминесцентного сигнала - 13 - Интенсивность хемилюминесценции, % в случае изученных анионных пероксидаз не требуется использования усилителей. Кроме того, сравнение полученных данных показало, что хотя катализ окисления люминола анионными пероксидазами имеет много общего, все же каждая из анализируемых анионных пероксидаз привносит некую специфику в катализ реакции окисления люминола.

II.3. Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе анионных пероксидаз II.3.1. Биосенсоры для определения пероксида водорода на основе анионных пероксидаз с прямым переносом электронов Хорошо известно, что пероксидазы являются рН-зависимыми ферментами. Более того, пероксидазы, выделенные из различных источников, проявляют максимальную активность при различных значениях рН. В этой связи биосенсоры, основанные на трех различных растительных пероксидазах (ПХ, ПП и ПБ), в первую очередь были протестированы при различных значениях рН (рис. 2.).

Для всех ферментов изучался прямой перенос электронов с поверхностьи электрода на фермент. Ранее было показано, что для ПХ, ПП и ПБ наблюдается 49 ± 4%, 56 ± 5%, 91 ± 6% активных молекул, участвующих в прямом переносе электронов, соответственно. Сравнение полученных данных демонстрирует, что биосенсоры на основе адсорбированных ПХ и ПБ имеют очень похожие профили рНзависимости сигнала в диапазоне от 3 до 7 с максимальным значением при рН 5-6. Для биосенсоров на основе ПП, напротив, наблюдается расширенная область максимального значения сигнала на профиле рН-зависимости (рис. 2).

Для таких биосенсоров высокие 2 3 4 5 6 значения тока были получены в pH Рис. 2. Влияние рН на ответ биосенсоров на диапазоне рН от 2 до 6. Данное основе ПП (сплошная линия), ПХ (пунктирная явление можно объяснить более линия), ПБ (штрих-пунктирная линия) для 0.высокой рН-стабильностью ПП по мМ H2O2 в 0.1 М фосфатном буфере при сравнению с ПХ и ПБ.

значении приложенного потенциала –50 мВ.

- 14 - I/I мах, % Для всех изученных пероксидазных электродов наблюдался высокий ответ при рН 6.0. При данном значении рН были получены градуироочные графики по пероксиду водорода для всех типов биосенсоров 10000 (рис. 3.). Полученные данные позволили рассчитать основные биоэлектрохимические параметры биосенсоров (чувствительность, S, 0 1000 2000 3000 4000 линейный диапазон, LR). Полученные [H2O2], мМ данные представлены в табл. 9.

Рис. 3. Градуировочные графики, полученные с Сравнение полученных данных помощью биосенсоров на основе ПП (сплошная линия), ПХ (пунктирная линия), ПБ (штриховая демонстрирует, что при сопоставимой линия). Экспериментальные условия: проточночувствительности биосенсоры на основе инжекционная система, приложенный анионной ПП обладают значительно потенциал –50 мВ, скорость потока 0.5 мл/мин, более широким линейным диапазоном 0.1 М фосфатный буфер, рН 6.0.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»