WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Алпеева Инна Сергеевна АНИОННЫЕ ПЕРОКСИДАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В БИОАНАЛИЗЕ 02.00.15 – катализ 03.00.23 – биотехнология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

ведущий научный сотрудник, доктор химических наук, профессор Иван Юрьевич Сахаров

Официальные оппоненты:

профессор, доктор химических наук Анатолий Николаевич Решетилов доктор биологических наук Ольга Владимировна Королева

Ведущая организация:

ФГУ Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Защита состоится 29 мая 2007 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан _ апреля 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук _ И.К. Сакодынская - 2 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка новых ферментативных систем, позволяющих усовершенствовать старые и предложить новые варианты анализа для целей здравоохранения и охраны окружающей среды является одним из важнейших и перспективных направлений современной биотехнологии, поскольку именно ферментативные методы обеспечивают высокочувствительное и селективное определение физиологически активных веществ. В этой связи поиск, получение и характеристика новых ферментов для аналитической биотехнологии является актуальной задачей.

Одним из наиболее широко применяемых в аналитических целях ферментов является пероксидаза (КФ 1.1.11.7). Этот биокатализатор - один из ключевых ферментов, контролирующих рост растений, их дифференциацию и развитие. In vitro этот фермент широко применяется в иммуноферментном анализе и при конструировании ферментных электродов.

Хотя пероксидазы обнаруживаются в тканях практически всех растений, в настоящее время основным источником коммерчески доступной пероксидазы являются корни хрена (Armoracia rusticana). В то же время появление пероксидаз с повышенной стабильностью и отличной субстратной специфичностью могло бы повысить качество фермент-содержащих наборов и стимулировать разработку новых аналитических методов и промышленных процессов. С этой целью в настоящее время проводятся исследования пероксидаз из новых источников. На Химическом факультете МГУ им.

М.В.Ломоносова под руководством д.х.н. Сахарова И.Ю. была впервые выделена пероксидаза из листьев пальм, которая обладала уникальной термостабильностью и кислотостабильностью, а также обладала повышенной стабильностью в органических растворителях. Учитывая многообразие флоры, можно предположить, что анионные пероксидазы растений из новых источников имеют хорошие перспективы для их практического использования в биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Изучение молекулярных и каталитических свойств анионных пероксидаз растений (сои, пальмы и батата) и возможности их применения в аналитической практике в качестве активных компонентов биосенсоров и метки в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией.

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

• Разработка метода выделения и очистки пероксидазы из кожуры клубней батата;

• Сравнительное изучение субстратной специфичности анионных пероксидаз (ПБ, ПП и ПС): по отношению к традиционно используемым - 3 - субстратам пероксидаз, металлоорганическим комплексам рутения, хемилюминесцентной реакции окисления люминола.

• Изучение свойств анионных пероксидаз в качестве компонентов биосенсоров: с прямым переносом электронов, с применением органических; с использованием медиаторов (комплекса осмия, модифицированных поливинилимидазолом); в биферментной системе с использованием алкогольоксидазы.

• Изучение свойств анионных пероксидаз в качестве метки в имунноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией на примере ПС.

Научная новизна работы. Впервые получена и детально охарактеризована пероксидаза батата. Выделенная пероксидаза батата была использована для изучения ее субстратной специфичности в сравнении с другими пероксидазами растений. Впервые показаны преимущества использования анионной пероксидазы пальмы в качестве компонента биосенсоров для определения пероксида водорода с прямым и медиаторным переносом электронов, а также в составе биферментных электродов с алкогольоксидазой для определения этанола в образцах вин. Впервые продемонстрированы преимущества использования анионной пероксидазы сои в сравнении с катионной пероксидазой хрена в качестве метки в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией на примере «сэндвич» тест-системы для определения IgG мыши.

Практическая значимость работы. Как следует из представленных ниже результатов, анионная пероксидаза пальмы является наилучшой пероксидазой для создания пероксидаз-содержащих электрохимических биосенсоров. Использование коммерчески доступной анионной пероксидазы сои в сравнении с пероксидазой хрена в составе иммуноферментных наборов с хемилюинесцентной детекцией позволяет существенно улучшить их качество за счет увеличения значения линейного диапазона в области высоких концентраций аналитов и большей стабильности хемилюминесцентного сигнала во времени. Также показана перспективность практического использования циклометаллированных комплексов рутения в качестве медиаторов при проведении ферментативного окисления фенолов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях «Биокатализ-2000» (Москва, 2000), «Биокатализ-2002» (Москва, 2002), «Биотехнология – состояние и перспективы развития, 2002» (Москва, 2002), «Биотехнология – состояние и перспективы развития, 2003» (Москва, 2003), «Joint Meeting Bioelectrochemistry-2005» (Коимбра, Португалия, 2005) и международном конгрессе по аналитической химии «ISAC-2006» (Москва, 2006).

- 4 - Публикации. По материалам диссертации опубликованы: 8 статей и тезисов докладов международных конференций.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы (три главы); описания материалов и методов исследования;

результатов и их обсуждения (четыре главы); выводов и списка цитируемой литературы, включающего 152 ссылки. Работа изложена на 130 страницах и включает в себя 45 рисунков и 25 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I. Выделение и очистка пероксидазы из кожуры клубней батата При скрининге тропических растений было найдено, что клубни батата содержат высокий уровень пероксидазной активности. Поскольку пероксидазная активность в кожуре была приблизительно в 30 раз выше, чем в мякоти, было высказано предположение, что основной пероксидазный пул локализован в кожуре. Подобная локализация может быть связана с участием ПБ в процессе суберилизации при формировании полифенольной матрицы.

Первоначально были оптимизированы условия получения экстракта из кожуры батата. Наиболее эффективно экстракция происходила при щелочных условиях (10 мМ боратный буфер, рН 9.0). Использование буферов с более низкими значениями рН (цитратный буфер, рН 3.0, ацетатный буфер, рН 5.0 и фосфатный буфер, рН 7.0) снижало выход экстракции и приводило к получению экстрактов с активностью ниже в 2.2-, 1.3- и 1.2- раза, соответственно.

Поскольку, как хорошо известно, пероксидазы в растительных источниках представлены как в растворимой, так и связанной с мембраной формах, в рамках представленной работы так же были изучены эффекты влияния ионной силы и детергента на выход экстракции ПБ. Оптимальное значение концентрации NaCl для экстракции при использовании боратного буфера с рН 9.0 составило 0.5 М. Повышение концентрации Тритона X-100 до 0.1% не оказывало влияния на пероксидазную активность получаемого субстрата.

Изучение кинетики экстракции показали, что для достижения максимума экстракции необходимо 3-х-часовая инкубации. Более длительная экстракция приводила к снижению ферментативной активности, связанное, по-видимому, с инактивацией пероксидазы фенолами и продуктами их окисления, параллельно экстрактируемыми из кожуры батата. Подобранные оптимальные условия экстракции ПБ позволили определить уровень пероксидазной активности в кожуре батата, равный 770 единиц на г веса кожуры.

- 5 - Результаты очистки ПБ представлены в Таблице 4.1. Как и многие другие экстракты из растительных источников, экстракт из батата содержал высокую концентрацию пигментов. Эти соединения (полифенолы) химически активны и могут необратимо модифицировать хроматографические носители, используемые для выделения ферментов. Для предотвращения такой модификации был разработан простой и быстрый метод удаления пигментов.

Он основывается на разделении пероксидазы и пигментов в водной двухфазной системе, состоящей из полиэтиленгликоля и сульфата аммония.

Максимальное удаление пигментов и наиболее высокий процент сохранения пероксидазной активности наблюдается в системе, содержащей 8.5% K2HPO4 и 14% ПЭГ (мм 10 000).

Табл. 1. Очистка пероксидазы из кожуры батата Удельная Суммарная Объем Концентрация Белок Выход Степень активность активность (мл) белка (мг) (%) очистки белка (U/мг) (U) Экстракция 1 290 4.9 6 300 42 265 000 100 пигментов Гидрофобная 190 1.4 270 700 189 000 70 хроматография Ионообменная 36 0.23 8.3 4 900 40 600 15 хроматография Дальнейшая очистка ПБ проходила с использованием гидрофобной хроматографии на колонке с Фенил-Сефарозой (рис. 2.). Сульфат аммония добавлялся до концентрации 1.7 М к раствору, содержащему пероксидазу, который затем был нанесен на колонку, уравновешенную 0.1 M фосфатным буфером, рН 6.5 с 1.7 М (NH4)2SO4. При таких условиях пероксидаза полностью адсорбировалась на Фенил-Сефарозе. ПБ элюировалась в градиентенте концентрации (NH4)2SO4 от 1.7 до 0 М в фосфатном буфере, рН 6.5. Стадия хроматографической очистки повысила удельную активность в 17 раз.

Конечной стадией очистки являлась ионообменная хроматография на колонке с DEAE-Toyopearl (рис. 3.), в результате которой удельная активность препарата, измеренная по отношению к гваяколу, составила 4 900 U/мг белка.

Очищенный препарат ПБ мигрировал в Ds-Na-электрофорезе как белок с молекулярной массой 37 кДа. Это значение было ниже, чем для мол. масса ПХ и близко к значениям ПС и пероксидазы табака.

Проведение изоэлекторофокусирования показало, что ПБ является анионным ферментом, значение pI которого составило 3,5. Ранее другие анионные пероксидазы были выделены из табака, пальмы, сои и других растений.

Спектр поглощения ПБ с максимумом при 401 нм (полоса Соре), 497 и нм характерен для всех пероксидаз растений. Значение RZ (отношение - 6 - поглощения при полосе Соре и 280 нм) составило 3.4, что также подтверждает высокую степень очистки полученного препарата ПБ.

II. Субстратная специфичность анионных пероксидаз II.1. Субстратная специфичность анионных пероксидаз в отношении традиционно используемых субстратов Так как способность окислять различные ароматические субстраты сильно варьирует в ряду растительных пероксидаз, в данной работе была исследована субстратная специфичность выбранных для изучения анионных пероксидаз (ПБ, ПП и ПС). Первоначально изучение проводилось в отношении традиционно используемых субстратов (доноров протонов) пероксидаз, а именно АБТС, о-фенилендиамина, о-дианизидина, феруловой кислоты, пирокатехина и гваякола. Поскольку субстратная специфичность ПП и ПС в отношении таких субстратов была уже описана, часть из которых была проведена в нашей лаборатории, для этих пероксидаз использовались литературные данные по субстратной специфичности к представленному ряду субстратов.

Хорошо известно, что оптимальные условия катализа для пероксидаз из различных источников могут сильно различаться. Поэтому для реакций ферментативного окисления исследуемых субстратов в присутствии ПБ были определены рН-оптимум, оптимальные концентрации пероксида водорода, субстрата-восстановителя и буфера (табл. 2.).

Табл. 2. Экспериментальные условия определения субстратной специфичности пероксидазы батата [H2O2], [AH], [буфер], Субстраты (AH),нм, M-1 cм-1 рН мМ мМ мМ АБТС 414 31 100 0,075 0,008 4,3 Феруловая к-та 318 6 000 0,5 0,3 4,5 o-дианизидин 420 30 000 4,2 11,4 4,5 o-фенилендиамин 445 11 100 4,2 5,5 5,0 2,5 5,5 5,5 гваякол 470 5 2,5 5,5 3,5 пирокатехин 295 1 700 1,0 25,0 5,5 При найденных выше (табл. 2.) наиболее благоприятных условиях была оценена эффективность катализа окисления изучаемых субстратов пероксидом водорода в присутствие ПБ. Как известно, катализ пероксидазы реализуется по механизму «пинг-понг» (1-3) с образованием двух промежуточных соединений - Cpd I и Cpd II.

kE + H2O2 Cpd I + H2O, (1) kCpd I + AH2 Cpd II + AH•, (2) - 7 - kCpd II + AH2 E + AH• + H2O. (3) Наиболее медленной реакцией, лимитирующей весь каталитический процесс, как показано было в случае пероксидазы хрена, является реакция между Cpd II и субстратом (АН2) (ур. 3). Поэтому для оценки эффективности катализа пероксидазы должна быть рассчитана величина константы реакции второго порядка (k3):

V k3 = -------------------, (4) [Cpd II] [AH2] где V – регистрируемая скорость окисления субстрата. Так как при оптимальной концентрации пероксида водорода концентрация Cpd II, как было показано ранее, практически совпадает с исходной концентрацией пероксидазы, то величина k3 приблизительно равна величине kэфф:

V k3 kэфф = --------------. (5) [Е]о [AH2] Аналогичный подход для оценки эффективности различных пероксидаз успешно применялся ранее.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»