WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Рассчитанное значение n[1O2] соответствует полученной из опыта величине скорости изменения оптической плотности D(440)/t раствора метиленового синего. Концентрации синглетного кислорода в других образцах определены по измеренным скоростям D(440)/t пропорционально этому соответствию.

Опираясь на экспериментальные данные (таблица 1), была построена зависимость стационарной концентрации синглетного кислорода, приведенной к плотности мощности 100 мВт/см2, от эффективной концентрации фуллерена (рисунок 3). Точки соответствуют изученным фуллеренсодержащим образцам.

Кроме того, для облегчения сравнения сенсибилизирующих свойств исследуемых композиций была введена удельная величина [1O2], которая представляет собой отношение стационарной концентрации синглетного кислорода к средней концентрации фотосенсибилизатора в растворе.

Таблица 1.

Результаты измерений стационарной концентрации синглетного кислорода [1O2], фотосенсибилизированного в водной среде исследуемыми системами, при I = мВт/см2.

Средняя [1O2], Удельная № Фотосенсибилизатор концентрация, 1016см-3 108см-3 [1O2]1 Теоретическое значение для мономера C60 8.40 1200.0 142.2 Раздробленные кристаллы C60 2.50 1.9 0.3 Частицы «аморфного» C60 12.00 12.0 1.4 Микрочастицы силикагеля с C60 8.40 9.5 1.Вакуумное напыление C60 на кварцевой 5 0.09 0.0 пластинке, L = 5 нм Вакуумное напыление C60 на кварцевой 0.6 1.70 1.пластинке, L = 77.5 нм Вакуумное напыление C60 на кварцевой 0.7 25.00 15.пластинке, L = 1350 нм На этом же графике была отложена кривая (пунктир), [1O2], 108 cm-полученная расчетом по /20 формулам (2) и (3) в предположении, что фуллерен находится в воде в виде мономеров. Учитывая нерастворимость С60 в воде, такая идеальная ситуация была нами названа псевдораствор фуллерена.

[C60], 1017 cm-Сенсибилизирующая способность молекул С60 в 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2. псевдорастворе показывает Рис. 3. Зависимость стационарной концентрации максимальные возможности синглетного кислорода от средней концентрации фуллерена как генератора фотосенсибилизатора в водной системе. – синглетного кислорода в вакуумное напыление разной толщины; – суспензия раздробленного кристаллического водной среде. Для расчета фуллерена; – суспензия «аморфного» фуллерена;

взято сечение поглощения – суспензия микрочастиц силикагеля, покрытых фуллерена, полученное из фуллереном. Пунктирная линия соответствует спектров растворов в CCl4, и псевдораствору фуллерена.

время жизни синглетного кислорода, характерное для водной среды.

Сравнение экспериментальной и теоретической кривых показало, что:

• введение понятия средней концентрации сенсибилизатора и применение ее при анализе эффективности генерации синглетного кислорода приводит к теоретически описываемой форме концентрационной зависимости;

• обнаружение синглетного кислорода, сенсибилизированного твердофазными фуллеренсодержащими композициями, свидетельствует об образовании достаточно долгоживущего триплетного возбужденного состояния агрегированного фуллерена;

• чем больше фуллерена в системе, тем больше концентрация получаемого синглетного кислорода;

• количество синглетного кислорода, вырабатываемое твердофазными фуллерен-содержащими фотосенсибилизаторами в воде приблизительно на два порядка меньше, чем то количество, которое могли бы производить отдельные молекулы фуллерена (псевдораствор).

• перспектива увеличения эффективности генерации синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов предполагает стремление к получению твердофазных композиций с поверхностным монослоем фуллерена, содержащим С60 в неагрегированном состоянии.

Анализ удельных значений [1O2] дополнительно показал, что:

1. использование вакуумно-напыленных покрытий C60 с толщинами 1350 нм и 5 нм и частиц нераздробленного кристаллического фуллерена в качестве фотосенсибилизаторов синглетного кислорода нецелесообразно;

2. оптимальная толщина слоя агрегированного фуллерена, обеспечивающая эффективное возбуждение молекул сенсибилизатора, составляет приблизительно от 30 до 300 нм;

3. агрегаты фуллерена, подобные с точки зрения их структурных особенностей, в различных твердофазных сенсибилизаторах обладают практически одинаковой эффективностью образования синглетного кислорода.

Сходство фотосенсибилизирующих свойств твердофазных фуллереновых композиций (2-4, 6 в таблице 1), на наш взгляд, не является случайным совпадением, а определяется сходством их структурных и физических особенностей. В самом деле, все рассматриваемые здесь покрытия и частицы отличаются единством состава: они содержат только С60, находящийся в агрегированном виде. На рисунке 4 представлены спектры всех четырех композиций в сравнении со спектром фуллерена в растворе CCl4. Анализ спектров показывает, что эти твердофазные композиции характеризуются схожей степенью агрегации фуллерена. То же самое справедливо и в отношении толщин покрытий и размеров частиц. На наш взгляд, это величины одного порядка, причем D отвечающие условиям 3 оптимального возбуждения x фуллерена: толщина покрытия, полученного вакуумным напылением фуллерена на кварце, в данном случае составляет 77.5 нм; диаметр 1 агрегата «аморфного» фуллерена равен 20-30 нм, с учетом возможной агломерации, нм – около 100 нм; толщина 300 400 500 600 агрегатов С60 на поверхности силикагеля по нашим Рис. 4. Спектры поглощения фуллерена в теоретическим расчетам (при твердофазных фуллерен-содержащих системах сравнительно со спектром раствора фуллерена. 1 – равномерном распределении суспензия аморфного фуллерена; 2 – суспензия фуллерена по поверхности) раздробленного кристаллического фуллерена; 3 – может составлять до 50 нм;

микрочастицы силикагеля, покрытые фуллереном;

средний размер частиц 4 – вакуумное напыление на кварце, L = 77.5 нм;

раздробленного 5- раствор С60 в ССlкристаллического фуллерена приблизительно равен 300 нм. Небольшие отличия в величине удельной стационарной концентрации синглетного кислорода для этих фотосенсибилизаторов, на наш взгляд, могут объяснятся несколько различной величиной удельной поверхности и степени ее дефектности, что отражается на концентрации поверхностных локализованных экситонов, по-видимому, обуславливающих процесс генерации синглетного кислорода.

Кроме того, нами было проведено сравнение количества полученного синглетного кислорода при замене среды с Н2О на D2О при прочих равных условиях, которое подтвердило факт образования синглетного кислорода в реакционной смеси. Действительно, время жизни синглетного кислорода в Н2О (2-3 мкс) с учетом тушения синглетного состояния О2 гистидином по нашим оценкам составляет 1 = 1.2 мкс, а в D2О (43 мкс) уменьшается за счет гистидина до 2 = 1.9 мкс, следовательно, использование D2O вместо H2O должно привести к увеличению эффекта в 2/1 = 1.58 раза, что хорошо согласуется с полученными экспериментальными данными и не зависит от концентрации С60 (таблица 2).

Таблица 2.

Изменение стационарной концентрации синглетного кислорода, образованного фуллереном, нанесенным на микрочастицы силикагеля, при замене среды Эффективная концентрация [1O2](D2O) / [1O2](H2O) С60, мг/мл 3.27 1.1.63 1.Поскольку, как упоминалось ранее, в водной среде, не содержащей электронодонорных соединений, возбужденный С60 будет способствовать образованию только синглетного кислорода, то изучение эффективности генерации О2 поможет оценить потенциальные возможности исследуемой композиции в качестве фотосенсибилизатора для инактивации вирусов в такой модельной среде.

Проведенные нами расчеты учитывали экспериментальные условия, отвечающие реальному процессу эффективной фотодинамической инактивации вирусов: облучение видимым диапазоном спектра с плотностью мощности мВт/см2, концентрация фуллерена - 2.7 мг/мл (соответствует условиям полученной нами полной инакцивации вирусов гриппа частицами силикагеля с нанесенным на них фуллереном), концентрация метиленового синего - 3.710-мг/мл (соответствует стандартной процедуре «Терафлекс» фирмы MacoPharma, Франция). Расчеты показали, что в данных условиях величина стационарной концентрации синглетного кислорода, нарабатываемой в водной среде твердофазным фотосенсибилизатором на основе фуллерена, (2.61010 см-3) не уступает и даже превышает упомянутую величину для метиленового синего (0.61010 см-3), используемого трансфузиологами в настоящее время. Таким образом, мы можем предположить, что сенсибилизирующей способности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, достаточно для проведения эффективного технологического процесса инактивации вирусов в водной среде, не содержащей электронодонорных соединений.

Наилучшей среди исследованных композиций с точки зрения создания высокой стационарной концентрации синглетного кислорода в процессе фотодинамической инактивации вирусов была признана твердофазная композиция, представляющая собой частицы силикагеля с нанесенным на них фуллереном.

Четвертая глава. Изучение фотостабильности твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов В настоящей главе была изучена фотостабильность покрытий фуллерена на стеклянных пластинах и микрочастицах силикагеля по сравнению с эталонным фотосенсибилизатором (метиленовым синим). Для выяснения возможных механизмов убыли фуллерена при облучении твердофазные покрытия были исследованы как в водной среде, так и на воздухе.

Интенсивность, спектральный состав и максимальная длительность облучения были выбраны из условия соответствия параметрам облучения, применявшемся нами при экспериментальном моделировании реального технологического процесса инактивации вирусов твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов.

Фотостабильность определялась двумя способами:

1. по изменению спектров поглощения суспензии или раствора фотосенсибилизатора в H2O в результате облучения;

2. по изменению эффективности генерации синглетного кислорода (1 O2) в результате предварительного облучения фотосенсибилизатора.

Анализ полученных результатов показал, что при длительном (2-3 часа) облучении интенсивным (100 мВт/см2) источником видимого диапазона фуллереновые покрытия в воде более фотостабильны, чем раствор метиленового синего. Об этом свидетельствуют как данные измерения спектров поглощения (рис. 5), так и результаты регистрации эффективности образования синглетного кислорода. Кроме того, наблюдается корреляция хода зависимости изменения спектра поглощения при облучении с ходом зависимости снижения сенсибилизирующей способности при тех же условиях для каждого из фотосенсибилизаторов.

Фотодеградация фуллеренового покрытия происходит только в приповерхностном слое, что является причиной несоответствия абсолютных значений изменений эффективности генерации синглетного кислорода фуллереном, нанесенным на микрочастицы силикагеля, (~ 30% за 2 часа) и убыли фуллерена, наблюдаемой по спектру (~ 5% за 2 часа).

Несмотря на то, что фотостабильность фуллереновых покрытий, как оказалось, не зависит от среды, механизмы убыли фуллерена в составе покрытий на воздухе и в воде различны: предположительный превалирующий механизм убыли фуллерена на воздухе – окисление, в воде – фотополимеризация.

Высокая фотостабильность покрытий фуллерена С60 как в водной, -так и в газовой среде обуславливает -перспективность их -применения в -фотодинамической терапии.

--0 20 40 60 80 100 t, мин Рис. 5. Относительное уменьшение концентрации фотосенсибилизаторов в зависимости от времени облучения: – суспензия микрочастиц силикагеля с фуллереновым покрытием, – раствор метиленового синего.

Пятая глава. Изучение принципиальных возможностей твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации вирусов in vitro В настоящей главе приводятся экспериментальные доказательства тропности агрегированного фуллерена к оболочечным вирусам и эффективной инактивации оболочечных вирусов in vitro (в физиологическом растворе и реальной биологической жидкости - аллантоисной жидкости куриного эмбриона) твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов.

Кроме того, выполнен окончательный выбор оптимального твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллерена в соответствии с основным требованиям, предъявляемым нами к твердофазным фотосенсибилизаторам, пригодным к использованию в установках по очистке плазмы и препаратов плазмы крови.

Работа по инактивации оболочечных вирусов in vitro была проведена в НИИ Гриппа РАМН совместно коллективом ФГУП «НПК «ГОИ им. С.И.

Вавилова», НИИ Гриппа РАМН и Институтом экспериментальной медицины РАМН с участием автора в части изготовления твердофазных фотосенсибилизаторов и анализа результатов.

C/C, % Проведенные эксперименты показали зависимость наблюдаемых процессов инактивации оболочечных вирусов (например, см. рис. 6) от концентраций фуллерена и кислорода, а также дозы освещения. Таким образом, деструктивное действие твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов было связано с образованием активных форм кислорода, прежде всего синглетного кислорода.

Полученные твердофазные композиции, представляющие собой частицы силикагеля с нанесенным на них слоем 0 1 2 3 4 фуллерена, представляются Время облучения, час оптимальной композицией, Рис.6. Инактивация вируса гриппа (A/PR/8/т.к. отличаются высокой (H0N1)) в физиологическом растворе.

прочностью нанесенного Фотосенсибилизатор – фуллерен, нанесенный на слоя, воспроизводимостью частицы силикагеля. Содержание фуллерена – 1.свойств независимо от мг/мл, удельная интенсивность облучения – партии получения, хорошей мВт/см3. Облучение - 100 мВт/см2 в диапазоне длин смачиваемостью в воде, волн 400-850 нм. Погрешность определения инфекционного титра вируса – 0.5 кроме того, характеризуются высокой эффективностью генерации синглетного кислорода и инактивации оболочечных вирусов, а также удобством при работе с ними и при извлечении их из вязких биологических жидкостей.

Инфекционный титр вируса. lg DIE

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»