WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

превалированием процесса образования синглетного кислорода молекулярным фуллереном над обратным процессом тушения синглетного кислорода фуллереном; низкой токсичностью; высокой фотохимической стабильностью.

Анализ литературы показал, что для создания твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов целесообразнее использовать немодифицированный фуллерен. В свою очередь получение твердофазной композиции, содержащей мономеры немодифицированного фуллерена, представляется достаточно сложной задачей. Поэтому было важно выяснить вопрос, касающийся влияния агрегации молекул на время жизни возбужденных состояний фуллерена и, таким образом, на эффективность генерации активных форм кислорода, приводящих к инактивации вирусов. Приведенный в настоящей главе анализ исследований по данной проблеме показал, что: (1) агрегация молекул С60 способствует уменьшению времен жизни состояний (3P*) и (1P*) фуллерена; (2) для каждого конкретного вида агрегатов фуллерена необходимо отдельно решать вопрос об эффективности тушения возбужденных состояний в кластере, поскольку она зависит от степени агрегации и силы взаимодействия фуллеренов в агрегате.

В связи с этим было рассмотрено влияние уменьшения времен жизни состояний (3P*) и (1P*) фуллерена на эффективность генерации синглетного кислорода. На основании немногочисленных, но непротиворечивых и очевидных, литературных данных показано, что самотушение возбужденных состояний фуллерена при агрегации приводит к снижению квантового выхода синглетного кислорода.

Кроме того, был изучен вопрос о генерации радикалов фуллерена при агрегации С60, приводящих к образованию радикалов кислорода (реакция типа I). Показано, что фуллерен, находясь в возбужденном состоянии в присутствии эффективных доноров электронов, является прекрасным акцептором электронов. Таким образом, фотовозбуждение неагрегированного Сспособствует передаче электрона от донора к С60* с образованием анионрадикала С60 (С60•-). Что касается агрегированного фуллерена, то несмотря на снижение времен жизни возбужденных состояний, С60, находясь в неполярном растворителе в присутствии достаточного количества доноров электронов, также способен к эффективной генерации С60•-.

Таким образом, показано, что наличие долгоживущего триплетного состояния фуллерена при облучении в водных средах способствует генерации синглетного кислорода (в условиях отсутствия электронодонорных соединений) и всех видов активных форм кислорода (в присутствии электронодонорных соединений).

В свою очередь для проведения эффективного технологического процесса селективной инактивации вирусов агрегированный фуллерен должен обладать не только высокой сенсибилизирующей способностью, но также избирательным воздействием на вирусы и достаточно высокой фотостабильностью. Кроме того, при работе с биологической жидкостью следует учитывать большую вязкость среды и влияние ее биологических компонентов на ход процесса инактивации. Перспектива применения твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для инактивации вирусов в биологических жидкостях (например, в плазме крови) приводит к необходимости изучения вышеупомянутых факторов.

Вторая глава. Разработка и получение твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов. Изучение их структурных свойств В данной главе описано изготовление и исследование структурных свойств твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов. Для этого на основании литературного обзора были сформулированы основные требования, предъявляемые нами к твердофазным фуллеренсодержащим фотосенсибилизаторам, пригодным к использованию в процессе очистки плазмы и препаратов плазмы крови: простота получения и воспроизводимость физико-химических свойств; возможность сохранения высокой эффективности генерации активных форм кислорода фуллеренами в гетерогенных условиях;

химическая и физическая устойчивость твердофазных фуллеренсодержащих фотосенсибилизаторов под действием излучения в водных средах; хорошая смачиваемость водными средами; полная извлекаемость фотосенсибилизаторов из биологической среды после процедуры фотодинамического воздействия;

технологичность их практического использования в процессах инактивации вирусов; высокая способность к инактивации вирусов в биологических жидкостях, обладающих высокой вязкостью.

Для выполнения этих требований были предложены, изготовлены и исследованы: (1) раздробленный кристаллический фуллерен и его водная суспензия; (2) «аморфный» фуллерен и его водная суспензия; (3) пластины с нанесенным на них слоем фуллерена; (4) микрочастицы силикагеля с нанесенным на них слоем фуллерена и их водная суспензия.

Для исследования структуры твердофазных фотосенсибилизаторов были использованы: рентгеноструктурный анализ; спектрофотометрия; элементный анализ; электронная микроскопия; динамическое светорассеяние. Также было показано, что для качественного определения степени агрегации фуллерена с успехом может применяться спектральный анализ.

Приготовленная суспензия раздробленного кристаллического фуллерена, полученная в процессе обработки суспензии кристаллического фуллерена ультразвуком, характеризовалась большой неоднородностью частиц по размеру, а процесс ее получения – недостаточной воспроизводимостью.

В связи с этим, был предложен способ получения суспензии фуллерена в воде, характеризующийся узким распределением частиц по размеру. В качестве первой стадии процесса был взят способ получения водного мицеллярного раствора фуллерена по методу Г.В. Андриевского1. Были оптимизированы условия получения устойчивого мицеллярного раствора фуллерена в воде, а также разработаны и предложены современные и более информативные условия изучения таких растворов методом электронной микроскопии.

Принимая во внимание тот факт, что процессы инактивации вирусов происходят в среде, содержащей определенное количество неорганических солей, было изучено поведение и свойства мицеллярного раствора фуллерена при добавлении в водный раствор физиологического количества хлористого натрия (0.9 %). В результате такой модификации Рис.1 Рентгенограмма лиофильно гидратная оболочка мицелл высушенных частиц суспензии разрушается, и мицеллярный раствор раздробленного кристаллического превращается в суспензию однородных фуллерена (1) и модифицированного водного мицеллярного раствора по размеру частиц фуллерена. Методом фуллерена (2) электронной микроскопии было показано, что средний размер таких частиц приблизительно составляет 20-30 нм.

Структура лиофильно высушенных частиц полученных суспензий фуллерена была изучена рентгенографическим методом, полученные рентгенограммы представлены на рис.1. На рентгенограмме четко видны пики, характеризующие кристаллический фуллерен, вместе с гало, которые могут трактоваться как характеристика аморфной составляющей полученных порошков. Таким образом, методом модификации водного мицеллярного раствора С60 получена дисперсная фуллереновая композиция, представляющая собой аморфный фуллерен (67%) с примесью кристаллического фуллерена (33%) и методом ультразвуковой обработки суспензии кристаллического фуллерена – кристаллический фуллерен (60%) с примесью аморфного фуллерена (40%).

Однако оказалось, что ни суспензия раздробленного кристаллического фуллерена, ни суспензия условно названного «аморфным» фуллерена не могут обеспечить достаточную технологичность их практического использования в процессах инактивации вирусов. Они характеризовались недостаточно хорошей извлекаемостью и постепенным снижением инактивационной активности Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk O.M., Shelkovsky V.S. and Vashchenko L.A., On the Production of an Aqueous Colloidal Solution of Fullerenes // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. - 1995. – Vol. 12. - P. 1281-вследствие укрупнения мелких частиц фотосенсибилизатора в вязких биологических средах.

В связи с этим было предложено создать фотосенсибилизаторы на основе фуллеренсодержащих покрытий. Такие структуры не подвержены агрегации в процессе фотодинамического воздействия в вязких биологических средах.

Были разработаны фуллеренсодержащие покрытия на пластинах. Однако при использовании пластин с покрытием фуллерена в биологических экспериментах наблюдалась невысокая степень инактивации вируса. По всей видимости, это может объясняться незначительной площадью поверхности, содержащей фуллерен.

С целью увеличения рабочей площади поверхности твердофазных сенсибилизаторов был предложен и разработан способ нанесения покрытия из фуллерена на частицы силикагеля. В качестве матрицы был выбран микропористый силикагель марки КСК отечественного производства. Методом элементного анализа на содержание углерода было установлено, что покрытие из фуллерена на частицах силикагеля составляет в среднем 3-4 % вес. к весу всей композиции.

Полученные фуллеренсодержащие поверхности, в первую очередь микрочастицы силикагеля с нанесенным на них фуллереном, наилучшим образом соответствуют сформулированным нами характеристикам оптимального фотосенсибилизатора по совокупности параметров хорошей смачиваемости водными средами, простоты получения и воспроизводимости физико-химических свойств. Кроме того, по результатам спектрального анализа показано, что во всех разработанных композициях фуллерен находится в агрегированном виде.

Третья глава. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллерена В настоящей главе описаны результаты обнаружения синглетного кислорода, образованного в результате облучения твердофазных фуллеренсодержащих фотосенсибилизаторов в водной среде. Изучение эффективности генерации синглетного кислорода одновременно позволяет качественно судить об образовании триплетного возбужденного состояния фуллерена, а также сделать выводы о потенциальных возможностях исследуемых композиций в качестве фотосенсибилизаторов для инактивации вирусов в модельной водной среде, не содержащей элекронодонорных соединений.

Прежде всего, по наблюдению люминесценции синглетного кислорода на длине волны 1270 нм было установлено образование синглетного кислорода в суспензиях фуллеренсодержащих микрочастиц («аморфный» фуллерен, раздробленный кристаллический фуллерен и силикагель, покрытый фуллереном), и на поверхности покрытий фуллерена на стеклянной/кварцевой подложке. Было определено время жизни синглетного кислорода в воде (2-мкс) и тяжелой воде (43 мкс). На примере облучения суспензии микрокристаллического фуллерена было показано, что интенсивность люминесценции прямо пропорциональна интенсивности возбуждающего импульса.

Однако оказалось, что определению количества образуемого кислорода люминесцентным методом мешают многочисленные систематические ошибки, поэтому было предложено обратиться к высоко чувствительному фотохимическому методу количественного определения О2 в водных средах, предложенному Kraljic and Mohsni1. В качестве «ловушки» синглетного кислорода в этом методе выступает аминокислота – гистидин, в качестве индикатора синглетного кислорода - п-нитрозодиметиланилин (RNO), характеризующийся интенсивной полосой поглощения с максимумом m = нм и полушириной 1/2(FWHM) = 75 нм. При реакциях, протекающих по такой схеме, падение оптической плотности раствора, регистрируемой на длине волны 440 нм, D(440) < 0, должно быть прямо пропорционально увеличению концентрации синглетного кислорода, наработанного за время наблюдения.

Поскольку выбранный нами метод был первоначально разработан для растворов, то при применении его к твердофазным сенсибилизаторам были учтены некоторые дополнительные факторы: возможная сорбция молекул RNO на твердофазном образце, его нагрев в процессе облучения и связанная с ним термодесорбция RNO обратно в раствор, оседание образца в процессе облучения. Была создана установка непрерывного измерения изменения оптической плотности раствора (рис 2).

Запись сигналов велась на компьютере с использованием двухканальной осциллографической приставки в режиме самописца. Отношение амплитуд Imax/I0max этих двух сигналов выражало собой зависимость пропускания системы от времени T(t). Начальный участок (первые 1–3 минуты) аппроксимации этой зависимости позволяет рассчитать скорость уменьшения оптической плотности раствора, связанного с наработкой синглетного кислорода:

D/t = –lg[T(t+t)/T(t)]/t. (1) Дополнительный контроль результатов осуществлялся сравнением спектров пропускания смесей до и после облучения, записываемых независимо на спектрофотометре в каждом опыте.

Kraljic I., Mohsni S.Et.. A New Method for the Detection of Singlet Oxygen in Aqueous Solutions // Photochemistry and Photobiology. – 1978. – Vol. 28. – P. 577-581.

Количественное определение абсолютного значения концентрации синглетного кислорода для исследуемых фотосенсибилизаторов было предложено выполнить путем сравнения получаемых значений D/t с величиной этого эффекта в растворе эталонного сенсибилизатора, для которого квантовый выход синглетного кислорода хорошо известен. В опытах в качестве эталонного сенсибилизатора был использован краситель метиленовый синий.

PD PP M Cu SC PP LMOD DHe-Cd О DРис. 2. Экспериментальная установка по наблюдению наработки синглетного кислорода в водном растворе фотохимическим методом. Cu – источник возбуждающего излучения (510 и 578 нм с соотношением интенсивностей 3:2; 15 кГц;

1 Вт/см2); L1, L2 – линзы; PP – плоско-параллельные пластины; M –зеркало; He-Cd – источник зондирующего излучения (441.5 нм; < 1mW); MOD – частотный модулятор;

SC – образец; D1 – детектор опорного излучения; D2 – детектор прошедшего излучения; PD – измеритель мощности Расчет абсолютного значения стационарной концентрации синглетного кислорода n[1O2] был выполнен для раствора метиленового синего по формуле:

n[1O2] = na[h](1O2)(1O2), (2) где na[h] – количество квантов возбуждающего излучения, поглощенных единицей объема вещества в единицу времени; (1O2) – интегральный квантовый выход генерации синглетного кислорода исследуемым фотосенсибилизатором; (1O2) – время жизни синглетного кислорода в среде.

Концентрация поглощенных квантов с учетом поглощения в толстом слое вещества определялась по формуле:

na[h] = (3), I() ( 1- e-D()H)d, hc H где I() – распределение интенсивности в спектре возбуждающего светодиода;

D() – спектр оптической плотности сантиметрового слоя раствора; H – высота столба облучаемой жидкости.

Для расчета было принято эффективное время жизни синглетного кислорода с учетом присутствия в растворе гистидина - = 1.2 мкс;

интегральный квантовый выход генерации синглетного кислорода метиленовым синим в воде в диапазоне длин волн 550-700 нм - 0.52.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»