WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |

Активация 1-адренорецепторов сопровождается каскадом реакций с участием ионизированного кальция и протеинкиназы С. При активации 2-адренорецепторов происходит ингибирование аденилатциклазы и, как следствие, снижение уровня цАМФ в клетке. В следующей серии экспериментов мы инкубировали эритроциты с катехоламинами в присутствии ингибитора протеинкиназы С стауроспорин агликона или с реагентами, повышающими уровень цАМФ (простагландин Е1 и проникающий аналог цАМФ).

Все эти реагенты в значительной степени нивелировали эффект адреналина на агрегацию эритроцитов, в то время как стимулирующее действие норадреналина снизилось только в присутствии стауроспорина. Что подтверждает предположение о том, что эффект адреналина опосредуется стимуляцией как 1-, так и 2-адренорецепторов, а действие норадреналина осуществляется путем активации 1адренорецепторов.

0,0,0,4 контроль 0,КА 0,* КА+кори 0,КА+йох * 0,КА+атено 0,* 0,КА+про 0,Адр НА Рис. 9. Изменение степени агрегации (СА) эритроцитов, стимулированной катехоламинами (КА) в присутствии - и адреноблокаторов: коринантина (кори), йохимбина (йох), атенолола (атено) и пропранолола (про) То, что оба катехоламина активируют 1-адренорецепторы, свидетельствует о том, что их действие связано с повышением уровня ионизированного кальция. Известно, что увеличение входа кальция в эритроциты сопровождается Гардош-эффектом, т.е. компенсаторным выходом калия из клетки. Учитывая, что Гардош-эффект полностью ингибируется в присутствии хлорида бария, мы использовали обработку эритроцитов катехоламинами в сочетании с добавлением в среду 2,мМ BaCl2. Кроме катехоламинов, эритроциты подвергались также инкубации с фторидом натрия, который, как известно, напрямую, без участия гормон-стимулируемых рецепторов активирует ГТФсвязывающие белки.

Во всех указанных случаях проагрегантный эффект и катехоламинов, и фторида натрия значительно снижался в присутствии BaCl2, что свидетельствует о том, что стимулирующее действие катехоламинов на процесс агрегации эритроцитов сопровождается изменением ионного гомеостаза клеток, а именно, Гардош-эффектом (выходом из клетки калия в ответ на повышение уровня внутриклеточного кальция).

Использование -адреноблокаторов не позволило получить достоверного уменьшения проагрегантного эффекта -агонистов. Высокая степень агрегации при использовании адреноблокатора пропранолола, возможно, объясняется тем, что пропранолол, сам по себе, является одним из хорошо известных индукторов Гардош-эффекта, хотя механизм его действия пока изучен недостаточно (Wiley J.S. et al., 1982).

СА, отн. ед.

6. Влияние групповой (АВ0) принадлежности эритроцитов на их агрегатные свойства При общей интенсификации процесса агрегатообразования под действием катехоламинов были выявлены значительные индивидуальные различия агрегационного ответа на адренергическую стимуляцию.

Такая же тенденция – выраженные индивидуальные различия эффекта адреналина на фильтруемость эритроцитов человека были описаны и в работе T. Oonishi et al. (1997). Варьирование эффекта адреналина на адгезивные свойства эритроцитов при серповидноклеточной анемии от пациента к пациенту выявлены и в исследовании P. Hines et al. (2003).

Одним из факторов, обусловливающих индивидуальные различия в свойствах эритроцитов, могут выступать их антигенные характеристики.

Наиболее выраженное статистически значимое повышение степени агрегации наблюдалось для эритроцитов группы 0 (I). Для всех остальных групп крови отмечена выраженная тенденция к росту агрегируемости под действием адреналина и норадреналина.

Для эритроцитов группы 0 (I) также зафиксирован максимальный агрегационный ответ на стимуляцию агонистами как -, так и адренорецепторов. Минимальный эффект адреномиметиков отмечен для эритроцитов группы AB (IY) – статистически значимый прирост степени агрегации наблюдался только при обработке 2-агонистом клонидином.

Инкубация с 1-агонистом фенилэфрином оказала существенный проагрегантный эффект на эритроциты, не имеющие на своей мембранной поверхности антигена А (группы 0 (I) и В (III)). Стимулирующее действие -агонистов (изопротеренола и фенотерола) и 2-агониста клонидина постепенно убывало от 0 (I) к AB (IY) группе крови (табл.

8).

В целом полученные нами результаты свидетельствуют о различной выраженности агрегационного ответа эритроцитов разной групповой принадлежности на однотипные адренергические воздействия.

Существенные отличия проагрегантного эффекта адренергических соединений для эритроцитов разной AB0 групповой принадлежности демонстрируют, что степень влияния этих соединений зависит от присутствия антигенных детерминант на мембране – в присутствии антигенов А и В воздействие минимальное, в их отсутствие (группа 0 (I)) – максимальное.

Таблица Степень агрегации эритроцитов разной групповой принадлежности после обработки катехоламинами и -, -адреномиметиками (M±m) Степень агрегации, отн. ед.

Условия эксперимента 0 (I) Rh + A (II) Rh + B (III) Rh + AB (IY) Rh + n = 10 n = 13 n = 12 n = Контроль 0,342±0,027 0,334±0,045 0,231±0,029 0,348±0,Адреналин 10-6 М 0,576±0,057* 0,403±0,034 0,291±0,049 0,429±0,Норадреналин 10-6 М 0,717±0,074* 0,421±0,044 0,294±0,041 0,395±0,Фенилэфрин 10-6 М 0,532±0,061* 0,443±0,055* 0,360±0,042* 0,410±0,Клонидин 10-6 М 0,543±0,043* 0,486±0,068* 0,329±0,048* 0,486±0,040* Фенотерол 10-6 М 0,595±0,072* 0,519±0,064* 0,346±0,051* 0,474±0,Изопротеренол 10-6 М 0,557±0,049* 0,466±0,051* 0,309±0,047 0,393±0,Выявленные особенности позволяют предположить, что присутствие антигенов на эритроцитарной мембране оказывает влияние на количество и/или функциональную активность адренорецепторов.

7. Оценка взаимосвязи агрегатных свойств эритроцитов с их мембранными свойствами Традиционно считается, что агрегации красных клеток крови способствует снижение поверхностного заряда, уменьшающее силы электростатического отталкивания. С целью оценки влияния электрофизиологических характеристик на процесс агрегатообразования были изучены изменения электрофоретической подвижности и -потенциала под действием ряда соединений, оказывающих выраженный проагрегантный эффект (адреномиметики и простагландины) (табл. 9).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что, несмотря на однонаправленное влияние этих препаратов на объединение эритроцитов в агрегаты, имеет место разнонаправленное изменение их электрофизиологических характеристик.

Из данных табл. 10 видно, что степень агрегации существенно повышена как при снижении (обработка ванадатом и фторидом натрия), так и при росте электрофоретической подвижности (инкубация с тромбином, кофеином, ацетилхолином) красных клеток крови.

Таблица Электрофоретическая подвижность (V) и дзета-потенциал () эритроцитов при действии агонистов адренорецепторов и простагландинов (M±m) V, мкм·с-1·В-1·см, мВ Контроль 1,289 ± 0,037 18,04 ± 0,Клонидин 10-6 М 1,178 ± 0,038* 16,49 ± 0,53* Фенилэфрин 10-6 М 1,374 ± 0,043* 19,24 ± 0,60* Изопротеренол 10-6 М 1,413 ± 0,061* 19,78 ± 0,85* Фенотерол 10-6 М 1,383 ± 0,055* 19,36 ± 0,77* ПГЕ1 10-8 М 1,312 ± 0,041 18,37 ± 0,ПГЕ2 10-8 М 1,152 ± 0,028* 16,13 ± 0,39* Таблица Изменение в % электрофоретической подвижности (ЭФП) и степени агрегации (СА) эритроцитов под действием препаратов Препарат Изменение в % от контроля ЭФП СА Тромбин 0,05 ед/мл +7,1** +42,3** Валиномицин 10-6 М –1,6 +99,5** DIDS 10-7 М –5,3 –31,5* Ванадат натрия 10-4 М –5,8 +63,9** Фторид натрия 10-3 М –3,7 +35,1* Кофеин 10-3 М +5,9 +37,9* Ацетилхолин 10-5 М +5,2* +45** Самый существенный прирост степени агрегации под действием валиномицина имел место на фоне неизменной электрофоретической подвижности, а выраженная тенденция к снижению поверхностного заряда после обработки DIDS сочеталась с ингибированием агрегации эритроцитов.

Поскольку изменения поверхностного заряда не оказывали определяющего влияния на агрегатные свойства эритроцитов, было решено проверить наличие взаимосвязи агрегации с другими мембранными свойствами красных клеток крови. При оценке изменения проницаемости и сорбционной способности мембран эритроцитов исследовали изменение этих показателей под действием хлорпромазина, который оказывает разупорядочивающее действие на липидный бислой.

Результаты изменения параметров, характеризующих проницаемость мембран (СПГ, СПГ50/55), сорбционной способности (ССЭ) и степени агрегации (СА) под действием хлорпромазина 10-5 М, представлены в табл. 11.

Таблица Влияние хлорпромазина на проницаемость (СПГ), сорбционную способность (ССЭ) и степень агрегации (СА) эритроцитов (M±m) Показатели Контроль Хлорпромазин Изменение, в % СПГ, % 30,6±2,1 32,4±1,4 +5,СПГ50/55, % 42,1±4,5 50,9±4,2** +20,ССЭ,% 49,6±2,5 44,8±2,0* –9,СА, отн. ед. 0,322±0,042 0,214±0,027*** –33,Таблица Коэффициенты корреляции между показателями агрегации (СА), сорбционной способности (ССЭ) и проницаемости мембран (СПГ) эритроцитов СА ССЭ СПГ -0,241 0,СПГ50/55 -0,232 0,Статистически значимых корреляций между сорбционной способностью мембран, их проницаемостью и степенью агрегации эритроцитов выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии обусловленности межэритроцитарных взаимодействий изменением этих мембранных характеристик (табл. 12).

8. Оценка роли внутриклеточного ионизированного кальция в процессе агрегации эритроцитов Поддержание низкой концентрации внутриклеточного кальция (на четыре порядка меньше, чем экстрацеллюлярного) и вход Ca2+ через плазматическую мембрану играют важную роль в генерации специфических сигналов и формировании клеточного ответа (Ткачук В.А., 2001).

В эритроцитах универсальной, единственной системой, регулирующей удаление кальция из клетки, является Са-насос, функционирование которого обеспечивается специальным ферментом – Мgзависимой, Са-стимулируемой АТФазой.

Контролируемое изменение внутриклеточного пула кальция достигалось двумя способами: 1) увеличением потока входящего в клетку кальция – с этой целью использовали стимуляторы этого процесса(Са ионофор А23187, тромбин и фторид натрия; и 2) ингибированием удаления кальция из клетки (инкубацией с ванадатом натрия, трифторперазином и стауроспорин агликоном). Специфического ингибитора СаАТФазы пока нет, однако известно, что Са-АТФаза эритроцитов активируется кальмодулином и протеинкиназой С, поэтому мы использовали ингибиторы этих регуляторных белков – трифторперазин и стауроспорин.

Инкубация эритроцитов со стимуляторами входа кальция привела к росту их агрегируемости. Присутствие различных ингибиторов СаАТФазы также способствовало повышению степени агрегации. Общим свойством всех использовавшихся реагентов была их способность повышать внутриклеточный пул кальция (независимо от механизма действия) (рис.10).

СА, % Рис. 10. Изменения степени агрегации (СА) в % при контролируемом повышении пула внутриклеточного кальция a н н и N Na зин ри т д а о мб п о да ер ри с A о тр на т рп ро о у ф ва т а т ф с три Увеличение концентрации внутриклеточного Са2+ приводит к открытию высокоселективных К-каналов в эритроцитах (Гардошэффекту). Ингибирование этого эффекта осуществляется введением в среду хлористого бария, в присутствии которого активация этих каналов исключается.

Ранее было показано, что стимуляция агрегации катехоламинами сопряжена с открытием Са-зависимых К-каналов. Было отмечено, что прагрегантный эффект ряда соединений (тромбина, кофеина, ацетилхолина и ванадата натрия) также нивелируется в присутствии BaCl(рис. 11).

0,35 контроль препарат препарат+BaCl0,0,0,0,0,0,ацетилхолин кофеин тромбин фторид Na ванадат Na Рис. 11. Изменение степени агрегации (СА) эритроцитов под действием препаратов в присутствии хлорида бария При физиологических концентрациях внутриклеточного Са (~ 2050 нМ) Гардош-каналы инактивированы, но они активируются при повышении содержания Са2+ в патологических или экспериментальных условиях. В интактных эритроцитах человека уровень Са, при котором активируются эти каналы, составляет ~ 150 нМ (Tiffert T. et al., 1988).

Количество Гардош-каналов в эритроцитах точно не установлено, по приблизительным оценкам оно составляет порядка 100-200 (Alvarez J.

et al., 1987; Hoffman J.F et al., 2003). В отличие от эритроидных клеток других видов млекопитающих, у которых активность Гардош-каналов утрачивается при созревании, зрелые эритроциты человека демонстрируют их устойчивую активность (Brown A.M. et al., 1978). Интересно, что такие Са-индуцируемые каналы отсутствуют в эритроцитах быка, СА, отн.ед.

которые не способны к агрегации (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981).

9. Оценка взаимодействия эритроцитов в условиях энергодефицита и при изменениях ионного гомеостаза При хранении крови в течение 2 часов при комнатной температуре отмечено существенное повышение уровня рН (на 4,3%, р<0,001), содержание ионизированного кальция в плазме достоверно снизилось (р<0,001), степень агрегации эритроцитов повысилась на 44%, р<0,01, зафиксированаа тенденция к увеличению среднего размера агрегатов (табл.13).

Коэффициенты корреляции между относительными изменениями степени агрегации и рН плазмы (СА/САисх и рН/рНисх), степени агрегации и концентрации свободного кальция в плазме (СА/САисх и рСа/рСаисх), составили r = 0,626 и r = 0,497 (р<0,05) соответственно.

Таблица Влияние хранения на физико-химические и агрегатные свойства крови Условия Агрегатные и физико-химические свойства крови (M±m) измерения СА, отн. ед. РА, отн.ед. рН плазмы рСа Интактные 0,134±0,024 4,78±0,39 7,77±0,04 2,74±0,После 2 ч хранения 0,193±0,028** 5,32±0,42 8,10±0,05*** 2,77±0,01*** Под действием метаболических ингибиторов также отмечен существенный прирост степени агрегации, наиболее выраженный при инкубации с йодацетамидом (на 50,8%, р<0,05) (табл.14).

Таблица Показатели агрегации эритроцитов под действием ингибиторов метаболизма (M±m) Показатели Среда инкубации агрегации 0,9 % NaCl Йодацетамид Дезоксиглюкоза (отн. ед.) (контроль) 5 мМ 30 мМ СА 0,301±0,041 0,454±0,059* 0,386±0,039* РА 4,63±0,35 5,15±0,45 4,52±0,Таким образом, полученные данные свидетельствуют о повышении агрегируемости эритроцитов в условиях энергодефицита. Известно, что ванадат натрия и истощение по АТФ оказывают триггерное действие на эффект Гардоша в эритроцитах человека, при этом была показана аддитивность этих факторов, несмотря на разные механизмы входа кальция в клетку (Kaiserova K. et al., 2002). В эритроцитах АТФ в основном потребляется ионными транспортными системами, которые обеспечивают осмотический баланс клетки (Nakayama Y. et al., 2005).

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»