WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Оценка вклада процесса агрегатообразования в повышение вязкости крови при низких скоростях сдвига и сравнительный анализ методов оценки агрегации эритроцитов При построении кривых вязкости суспензий эритроцитов с Ht=в агрегирующей (плазма) и неагрегирующей (физиологический раствор) средах было отмечено, что показатель консистенции суспензии эритроцитов в аутоплазме был в 1,71 раз выше (р<0,01), чем при суспендировании клеток в физиологическом растворе. Тенденция к росту индекса течения при переходе от одной среды к другой была статистически недостоверной (рис. 1).

y = 2,1752x-1,y = 1,6065x-1,R2 = 0,R2 = 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,напряжение сдвига, Па напряжение сдвига, Па А Б Рис. 1. Кривые вязкости суспензии эритроцитов с Ht=40 в плазме (А) и физиологическом растворе (Б) С целью оценки вклада процесса агрегатообразования эритроцитов в изменения вязкости крови при низких напряжениях сдвига была проведено сравнение ряда показателей, характеризующих межэритроцитарные взаимодействия, измеренных или вычисленных с помощью различных методов.

Степень агрегации эритроцитов измеряли фотометрическим методом (оценивали степень агрегации в стазе после высокосдвигового вращения М5 и М10 и при низкосдвиговом вращении – М15 и М110) и методом оптической микроскопии с видеорегистрацией (оценивали степень агрегации (СА) и средний размер агрегата (РА)). Динамический параметр (D5 и D10), рассчитывали для учета влияния условий течения на процесс объединения эритроцитов в агрегаты.

В качестве косвенного метода использовали определение суспензионной стабильности крови. Параллельно на одних и тех же образцах вязкость, мПа*с вязкость, мПа*с крови измеряли вязкость суспензий с Ht=40 в аутоплазме (пл) и в физиологическом растворе (фр).

Для оценки агрегации эритроцитов рассчитывали следующие показатели: реологический коэффициент (РК), коэффициент агрегации (КА), показатель агрегации (ПА). Степень агрегации, измеренная методом видеорегистрации, составила СА = 0,329±0,021 (отн. ед.), средний размер агрегата РА = 5,8±0,3 (отн. ед.). Результаты определения параметров процесса агрегатообразования с помощью полуавтоматического агрегометра представлены на рис.2.

Среднее значение М Мпоказателя агрегации, рассчитанного из значений суспензионной стабильности крови, составило ПА = 0,497±0,037 (отн.

5 с 10 с ед.).

режимы измерения Рис. 2. Степень агрегации эритроцитов, измеренная фотометрическим методом в стазе после высокосдивогового вращения (М) и в условиях низкосдвигового вращения (М1) Статистически значимых корреляций между этим показателем и результатами агрегатометрии фотометрическим методом и методом видеорегистрации выявлено не было. Эти результаты еще раз подтверждают точку зрения о многофакторности и неспецифичности теста СОЭ и нецелесообразности его использования в данных целях (Jurado R.L., 2001).

Корреляционный анализ не выявил статистически значимой взаимосвязи показателей степени агрегации, полученных прямыми методами, с результатами вискозиметрии. Однако была зафиксирована выраженная корреляция между показателями агрегации и расчетными вискозиметрическими параметрами (табл. 1). Статистически значимой взаимосвязи показателей агрегации, измеренных с помощью полуавтоматического агрегометра, с вискозиметрическими данными не выявлено. Слабо выраженная корреляция отмечена лишь между динамическим параметром D и некоторыми расчетными вискозиметрическими показателями (коэффициентом агрегации и показателем консистенции СА, отн. ед.

k суспензии эритроцитов в плазме и соотношением этих показателей для агрегирующей и неагрегирующей сред). Выраженная статистически значимая корреляция зафиксирована между динамическим параметром D и степенью агрегации (СА), измеренной методом видеорегистрации (r=0,862, р<0,01).

Таблица Коэффициенты корреляции между показателями агрегации и расчетными вискозиметрическими параметрами Показатели Коэффициенты корреляции агрегации КА РК kпл kпл/ kфр СА 0,573 0,738 0,862 0,D10 0,446 — 0,388 0,Обозначения: СА – степень агрегации, D – динамический параметр, КА – коэффициент агрегации, РК – реологический коэффициент, k – показатель консистенции Для метода видеорегистрации выявлена значимая корреляционная взаимосвязь с расчетными вискозиметрическими показателями. Исходя из полученных коэффициентов корреляции между СА и показателем консистенции суспензии эритроцитов в плазме, коэффициент детерминации составил 74,3%, при использовании соотношения таких показателей консистенции для плазмы и физиологического раствора коэффициент детерминации превысил 89%. Данные факты указывают на существенный вклад процесса агрегатообразования эритроцитов в проявление неньютоновских свойств крови при низкосдвиговом течении.

Полученные результаты свидетельствуют, что для оценки процесса агрегатообразования эритроцитов методами вискозиметрии представляется достаточно корректным использование таких расчетных параметров, как показатель консистенции k, полученный из кривой вязкости и отношение таких коэффициентов в агрегирующей и неагрегирующей средах.

Фотометрический метод оценки агрегации обладает определенными преимуществами при использовании в клинических условиях:

быстрота и простота выполнения, минимальное количество используемой крови. Однако применение этого метода в исследовательских целях имеет свои ограничения: невозможность оценить причину изменения светопропускания, поскольку это может быть связано не только с процессом агрегатообразования, но и с изменением формы, фрагментацией клеток при использовании различных препаратов и т.д.

Метод оптической микроскопии с видеорегистрацией позволяет рассчитывать степень агрегации, производить дифференцировку качественных характеристик наблюдаемых агрегатов (линейные, разветвленные, глыбчатые) и оценивать кинетику процесса агрегатообразования. Основным достоинством этого метода наряду с достаточной чувствительностью и выраженной корреляцией результатов с данными, полученными другими методами, представляется возможность непосредственного визуального наблюдения процесса объединения эритроцитов в агрегаты (в отличие от фотометрического или вискозиметрического методов), что позволяет учитывать возможные изменения формы клеток и морфологии агрегатов.

1. Влияние плазменных факторов на межэритроцитарные взаимодействия 2.1. Изменение уровня рН среды Метаболизм эритроцитов направлен на обеспечение их основной функции – транспорта кислорода, причем выполнение этой функции в значительной степени зависит от уровня кислотности крови (Kalhoff H.

et al., 1994).

При моделировании сдвигов рН плазмы было зафиксировано снижение степени агрегации при ацидификации и повышение при добавлении щелочного раствора (табл. 2).

Таблица Изменение степени агрегации эритроцитов при снижении и повышении уровня рН плазмы (M±m) Плазма+NaCl Плазма+HCl Плазма+NaOH рН 7,37±0,05 7,03±0,04** 7,76±0,07** степень агрегации 0,183±0,019 0,131±0,013* 0,252±0,021* Примечание: здесь и далее статистически значимые различия обозначены * – при р<0,05, ** – при р<0,01, *** – при р<0,001.

Анализ корреляционных зависимостей позволил выявить взаимосвязь агрегации эритроцитов и рН крови (рис. 3).

Для стандартного раствора с реофортаном минимальная степень агрегации эритроцитов также была зафиксирована при сниженном рН (7,0), максимальная – при рН=7,8. Коэффициенты корреляции между рН крови и степенью СА агрегации эритроцитов 0,R2 = 0,в стандартных раство0,рах реофортана соста0,вили: r (7,0) = 0,0,(р<0,05); r (7,4) = 0,0,(р<0,05); r (7,8) =0, рН крови (р<0,05).

7 7,2 7,4 7,6 7,8 Рис. 3. Корреляционная взаимосвязь степени агрегации эритроцитов в плазме (СА) и значения рН крови Выраженная взаимосвязь агрегируемости эритроцитов в разных средах и уровня кислотности крови (а не плазмы или сыворотки), выявленная на всех этапах эксперимента, позволила предположить обусловленность изменения агрегатных свойств при варьировании уровня кислотности вкладом скорее клеточного, чем плазменного уровня рН.

Среди возможных причин изменения степени агрегации при исследуемых сдвигах рН можно рассматривать следующие: известно, что при изменении рН в мембранах эритроцитов происходят различные изменения в структуре (нарушения связи между белковыми и липидными компонентами, между компонентами и ионами кальция и т.д.) (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981). Роль ионов кальция в межклеточных взаимодействиях хорошо известна (Oberleithner H. et al., 1982;

Ткачук В.А., 1983, 1994), в бескальциевой среде нарушаются любые клеточные контакты. При снижении рН плазмы усиливается конкуренция между ионами водорода и кальция за места адсорбции, что приводит к уменьшению количества мембраносвязанного кальция и, как следствие, к уменьшению агрегации (Левин С.В., 1976). При алкалозе концентрация ионов водорода снижается, что обеспечивает увеличение количества мест связывания кальция с мембраной эритроцитов и рост степени агрегации. По мнению I. Cicha и соавт (2003) одним из факторов, ингибирующих процесс агрегатообразования при снижении рН в кислую область является изменение формы эритроцитов (эхиноцитоз).

Сдвиг рН в щелочную сторону вызывает уплощение формы эритроцитов (т.е. увеличение соотношения площадь поверхности – объем).

Кроме того, было показано, что при повышении рН происходит ингибирование кальциевого насоса, который в эритроцитах является единственным механизмом удаления кальция из клетки (Hao L. et al., 1994). Следовательно, при повышении рН увеличивается возможность связывания экстрацеллюлярного кальция с мембраной эритроцита и вероятность повышения его внутриклеточного уровня. Таким образом, изменение рН среды может влиять на проявление регуляторных механизмов, обусловленных сигнальной ролью ионизированного кальция.

1.2. Изменение уровня свободного экстрацеллюлярного кальция Около половины общего кальция плазмы находится в ионизированном состоянии, а, следовательно, физиологически активно. Даже умеренное повышение содержания свободного кальция в плазме (на 20,6%) приводило к интенсификации агрегатообразования эритроцитов (на 80,4%, р<0,01). Было отмечено, что Са-индуцированный прирост степени агрегации дозозависим, и при физиологических концентрациях ионизированного кальция выявлена экспоненциальная зависимость степени агрегации от рСа (–log[Ca2+]) (рис. 4). При превышении физиологического уровня ионов кальция (выше 1,5–1,7 мМ) отмечалось формирование эхиноцитов.

СA 0,-2,6002x y = 279,47e 0,R2 = 0,0,0,0,0,pCa 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 Рис. 4. Зависимость степени агрегации (СА) от содержания свободного кальция (рСа) в плазме Са-индуцированное повышение агрегации значительно ингибировалось в присутствии ЭДТА (рис. 5).

Повышение содержания ионизированного кальция в плазме крови вызывает увеличение доли мембраносвязанного кальция. Он способен связываться с мембранными анионами (главным образом с карбоксильными группами белков и кислыми фосфолипидами). Известно, что обработка хелаторами кальция (ЭДТА) почти полностью (до 90%) удаляет мембраносвязанный кальций (Орлов С.Н., Шевченко А.С., 1978).

Ингибирование прироста агрегации после обработки ЭДТА свидетельствует об участии мембраносвязанного кальция в агрегатообразовании эритроцитов. Мембраносвязанный кальций способен значительно изменять не только поверхностный кле0,точный заряд, но и 0,свойства и структуру 0,клеточной мембраны 0,(Левин С.В., 1976).

СA Также повышается 0,вероятность входа 0,ионов в клетку.

0,1 2 Рис. 5. Степень агрегации эритроцитов: 1 – в аутоплазме; 2 – в аутоплазме с добавлением 1мМ CaCl2; 3 – в аутоплазме с добавлением 1 мМ CaCl2 и 1 мМ ЭДТА Косвенным свидетельством увеличения содержания внутриклеточного кальция может служить наблюдаемый при повышенной концентрации плазменного Ca2+ (1,5–1,7 мМ) эхиноцитоз. Известно, что рост содержания экстрацеллюлярного ионизированного кальция не вызывает трансформации эритроцитов при значительно более высоких значениях (до 50 мМ), однако эхиноцитоз наблюдается, если происходит повышение внутриклеточного уровня кальция (Черницкий Е.A., Воробей A.В., 1981).

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что концентрация ионизированного кальция в плазме оказывает влияние на процесс агрегатообразования эритроцитов. Изменения агрегабельности при этом связаны с модификацией мембранных свойств красных клеток крови.

1.3. Влияние белков свертывающей системы крови на объединение эритроцитов в агрегаты Важность роли фибриногена в процессе агрегатообразования эритроцитов показана в ряде исследований (Dintenfass L., 1981; Maeda N. et al., 1994), полученные нами данные полностью согласуются с известными фактами. В ходе исследования было установлено, что максимальная степень агрегации при микроскопии разбавленной крови наблюдалась для эритроцитов в аутологичной плазме; степень агрегации дефибринированной крови была значительно ниже (табл. 3), но имела место. При замене суспендирующей среды (плазмы) на сыворотку агрегация «молодых» эритроцитов снижалась в 2,37 раза, а «старых» – в 3,02 раза. При этом значительно сокращалась разница между степенью агрегации разных возрастных фракций эритроцитов.

Таблица Степень агрегации фракционированных по возрасту эритроцитов в плазме и сыворотке (M±m) Степень агрегации эритроцитов зрелые молодые старые В плазме 0,317±0,039 0,220±0,028* 0,393±0,025* В сыворотке 0,101±0,006 0,093±0,008 0,130±0,016* В механизме свертывания крови фибриноген занимает исключительное положение, так как представляет собой единственный субстрат, из которого под действием протеолитического фермента тромбина возникает волокнистая сеть фибрина – материальная основа сгустка, предупреждающая потерю крови. Однако фибриногену присущи и другие важные функции как в физиологических, так и патологических процессах – в заживлении ран, росте опухолей и метастазировании (Зубаиров Д.М., 2000).

Инкубация эритроцитов с тромбином привела к росту их агрегабельности на 43,9%, средний размер агрегата увеличился 18,2% (р<0,05). В присутствии дибутирильного аналога цАМФ и хлорида бария проагрегантный эффект тромбина полностью нивелировался, а при совместном действии тромбина и адреналина наблюдался аддитивный эффект. Тромбин одновременно является и мощным ингибитором аденилатциклазы, и эффективным агентом, повышающим уровень внутриклеточного кальция в тромбоцитах. Адреналин увеличивает чувствительность тромбоцитов к индукторам агрегации, повышающим Са2+in (тромбину, АДФ и др.) (Ткачук В.А., 1998). В ряде клеток активация тромбином инозитол-1,4,5,-трифосфата, приводящего к повышению уровня внутриклеточного кальция, подавляется коклюшным токсином (Houslay M., 1991).

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»