WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

Апробация результатов работы.

Материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены на международных конференциях «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль 1997, 1999, 2001, 2003, 2005 гг.), конференции молодых ученых России с международным участием, посвящ. 240-летию ММА им. И.М. Сеченова «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 1998), на II международном конгрессе «Central European Vascular Forum» (Италия, Рим, 2000), на XI Европейской конференции по клинической гемореологии (Франция, Руан, 2000), на II Всероссийском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), на международной конференции, посвящ. 75-летию со дня рождения А.М.

Уголева «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2001), на XYIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), на XI международном конгрессе по биореологии и IY международной конференции по клинической гемореологии (Турция, Анталья, 2002), на научно-практических конференциях «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2003, 2004, 2005), на XII Европейской конференции по гемореологии и европейской летней школе по биореологии (Болгария, София, 2003), на Третьей Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2004), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на I и II Всероссийских научных конференциях с международным участием «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2004, 2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 2004), на II Всероссийской научной конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2005), на XIII Европейской конференции по клинической гемореологии (Италия, Сиена, 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005).

По теме диссертации опубликованы 53 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием организации, материалов и методов исследования, 9 глав с изложением полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 47 рисунками. Библиографический указатель включает в себя наименований: 124 отечественных и 473 иностранных источника.

ОРГАНИЗАЦИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводили на венозной крови доноровдобровольцев (лиц обоего пола) разных возрастных групп. Общее количество исследованных образцов крови составило 513.

Основной объем исследований выполнен на образцах крови молодых практически здоровых мужчин в возрасте от 18 до 22 лет при следующем распределении по этапам эксперимента: 1) оценка вклада агрегации эритроцитов в реологические свойства крови при низкосдвиговом течении и сравнительная характеристика методов оценки процесса агрегатообразования (n=21); 2) изучение влияния уровня рН на агрегатные свойства эритроцитов (n=34); 3) оценка роли экстрацеллюлярного кальция (n=32); 4) исследование влияния биологически активных веществ на агрегатные свойства эритроцитов (n=36); 5) изучение влияния электрофизиологических характеристик эритроцитов (n=62);

6) изучение вклада внутриклеточного свободного кальция (n=45); 7) изучение агрегации эритроцитов в условиях энергодефицита и при изменениях ионного гомеостаза клетки (n=23); 8) исследование механизмов влияния адренергических соединений на процесс агрегатообразования эритроцитов (n=92) и 18 образцов крови практически здоровых доноров-добровольцев женщин в возрасте от 19 до 24 лет; 9) оценка мембранных свойств эритроцитов (сорбционной способности, проницаемости) (n=51) и кровь пациентов с гипертонической болезнью – лиц обоего пола в возрасте от 37 до 53 лет (n=31). При оценке степени агрегации эритроцитов и адренореактивности организма в норме и при патологии исследовали кровь здоровых мужчин (n=17) и лиц обоего пола с различными формами патологии: сердечно-сосудистыми заболеваниями (n=14); с дисциркуляторной энцефалопатией (n=16); с хронической обструктивной болезнью легких (n=7); с раком желудка (n=8) и сахарным диабетом (n=6).

В группах пациентов с различными формами патологии диагноз был поставлен лечащим врачом и подтвержден записью в амбулаторной карте. Исследование крови больных (за исключением пациентов с раком желудка) начинали после «периода отмывания» (не менее дней), в течение которого они не принимали лекарственные средства.

Часть больных вообще не лечилась до исследования длительное время.

Забор крови производился утром натощак из локтевой вены без наложения жгута в условиях клинической лаборатории квалифицированным медицинским персоналом после получения информированного согласия донора. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (Ед/мл). Все измерения и манипуляции с кровью проводились в течение 4 часов после ее забора. Эритроциты использовались в экспериментах после отделения от плазмы центрифугированием и 3-кратной отмывки в 0,154 М растворе NaCl.

1. Методы оценки процесса агрегатообразования эритроцитов 1.1. Эритроциты ресуспендировали в обедненной тромбоцитами аутологичной плазме при стандартном показателе гематокрита Ht = 0,5% и определяли степень агрегации с помощью метода оптической микроскопии с последующей видеорегистрацией и компьютерным анализом изображения (Муравьев А.В. и соавт., 2003).

1.2. Степень агрегации эритроцитов определяли с помощью полуавтоматического агрегометра типа МА1, разработанного на основе метода H. Schmid-Schnbein (Myrenne, Германия). Образец крови подвергался вращению со скоростью сдвига 600 с-1, после остановки степень агрегации измерялась и подсчитывалась автоматически для двух интервалов времени – 5 и 10 секунд (М5 и М10). После высокосдвигового режима вращения степень агрегации измеряли при низкой скорости сдвига – 3 с-1 также в двух временных интервалах (М15 и М110).

Динамический параметр D (D5 и D10), равный отношению показателей степени агрегации М1/М (М15/М5 и М110/М10), использовали для оценки влияния условий течения на процесс объединения эритроцитов в агрегаты (Schmid-Schnbein H., 1990).

1.3. Расчетные показатели из данных вискозиметрии и оценки суспензионной стабильности крови: оценку степени агрегации форменных элементов крови производили по L. Dintenfass (1972) как отношение объема эритроцитов, полученного в результате принудительного осаждения (центрифугирования), к аналогичному показателю после седиментации форменных элементов в покое (показатель агрегации ПА).

При сравнении вязкостей суспензий эритроцитов со стандартным показателем гематокрита (Ht=40) в разных (агрегирующих и неагрегирующих) средах рассчитывали коэффициент агрегации (КА), равный их отношению (Катюхин Л.Н., 1995): КА = пл/фр, где пл – кажущаяся вязкость суспензии эритроцитов в плазме; фр – кажущаяся вязкость суспензии эритроцитов в физиологическом растворе.

Для численной оценки неньютоновских свойств крови использовали реологический коэффициент (РК), равный отношению кажущейся вязкости при низких скоростях сдвига к высокосдвиговой кажущейся вязкости (Шабанов В.А., 1972): РК = `/.

2. Методы оценки свойств плазмы и суспензионной среды 2.1. Концентрацию ионизированного Са2+ и уровень рН жидких сред (крови, плазмы, сыворотки, стандартных растворов) оценивали методом прямой потенциометрии с использованием рН-метра (рН-150, Беларусь).

Для определения содержания ионизированного кальция использовали кальций-селективный электрод, для измерения рН – стеклянный электрод.

2.2. С целью устранения возможного влияния плазменных факторов на процесс объединения эритроцитов в агрегаты в ряде случаев степень агрегации оценивали в стандартной суспензионной среде с добавлением 3% реофортана (гидроксиэтилкрахмала), который в данной концентрации в буферном растворе обладает проагрегантными свойствами (Corry W.D. et al., 1983).

3. Методы оценки клеточных свойств 3.1. Измерения электрофоретической подвижности эритроцитов выполняли в микрокамере с плоскими хлор-серебряными электродами, в качестве электрофоретической среды использовали стандартный фосфатный буферный раствор (рН=7,38; 300 мОсм). Для вычисления потенциала эритроцитов использовали уравнение Смолуховского, определив электрофоретическую подвижность клеток и зная величины вязкости () и диэлектрической постоянной среды (D).

3.2. Сорбционную способность эритроцитов определяли колориметрированием по степени поглощения катионного (метиленовый синий) и анионного (метиловый оранжевый) красителей эритроцитарной массой.

3.3. Проницаемость эритроцитарных мембран оценивали по степени гемолиза клеток после инкубации в растворах с разным соотношением изотонического раствора мочевины и физиологического раствора. Рассчитывали общий средний процент гемолиза (СПГ) и средний процент гемолиза в области концентраций 50:50 и 55:45 (СПГ50/55) (Макшанова Г.П. и соавт., 2003).

3.4. Определение эритроцитарных антигенов системы АВ0 производили с помощью стандартных сывороток отечественного производства (НИИ г. Нижний Новгород) методом агглютинации на плоскости.

Резус-принадлежность устанавливали экспресс-методом в пробирках.

3.5. Фракционирование эритроцитов по возрасту производили по методу J. Murphy (1973), основанному на различии в плотностях эритроцитов разного возраста.

4. Реологические измерения 4.1. Кажущуюся вязкость крови и суспензий эритроцитов со стандартным показателем Ht=40 в разных средах (плазме, физиологическом растворе) измеряли с помощью полуавтоматического капиллярного вискозиметра (Муравьев А.В. и соавт., 2005). На основании полученных показателей вязкости, измеренных при разных напряжениях сдвига, строили кривые вязкости в координатах вязкость – напряжение сдвига. Эти зависимости с высокой степенью достоверности аппроксимировались степенной функцией вида y=kxn, характерной для псевдопластичных жидкостей, где k – показатель консистенции, n – индекс течения (Селезнев С.А. и соавт., 1985).

4.2. Измерение показателя гематокрита производили общепринятым методом с использованием микрогематокритной центрифуги ТН21 (Германия).

4.3. Скорости оседания эритроцитов гепаринизированной крови измеряли в капилляре Панченкова по методу A. Westergren через интервалы времени 15, 30, 45 и 60 минут с последующим построением СОЭ-граммы (зависимости высоты столбика эритроцитов в мм от времени в минутах).

4.4. Эффективность доставки кислорода к тканям рассчитывали по формуле: T = Ht/, (S. Chien, 1987; J. Stoltz et al., 1991).

5. Методы оценки адренергических воздействий на свойства эритроцитов 5.1. Определение адренореактивности организма производили по методу, предложенному Р.И. Стрюк и И.Г. Длусской (2003). Метод основан на факте торможения гемолиза эритроцитов, помещенных в гипоосмотическую среду, в присутствии -адреноблокатора. В дополнение к стандартной методике оценки адренореактивности по ингибированию гипоосмотического гемолиза эритроцитов в присутствии адреноблокатора пропранолола, параллельно исследовалась осмотическая резистентность эритроцитов в тех же условиях в присутствии эквимолярных количеств адренергических соединений: катехоламинов (адреналина и норадреналина), агонистов - и -адренорецепторов (клонидина и изопротеренола), -блокатора атенолола и антагонистов йохимбина и коринантина.

5.2. Определяли реакцию на адреномиметические вещества в возрастающих концентрациях. В системе координат Скэтчарда строили график зависимости доза – эффект, по которому определяли основные параметры адренергической реакции (Нестерова Л.А., Манухин Б.Н., 1983).

5.3. При совместном действии агониста и блокатора адренорецепторов последний вводился в среду инкубации на 5 минут раньше, чем адреномиметик. При оценке сочетанного эффекта гормонов инсулин вводили в среду инкубации за 5 минут до катехоламинов.

6. Модельные эксперименты 6.1. Изменения рН суспензионной среды моделировали добавлением к аутоплазме или стандартному раствору 0,05Н растворов HCl (ацидификация) и NaOH (алкалинизация). В качестве контроля для исключения эффекта дилюции использовали аутоплазму с добавлением такого же объема 0,9% раствора NaCl.

6.2. Контролируемые изменения уровня свободного кальция плазмы: эритроциты ресуспендировали в аутоплазме с добавлением раствора хлорида кальция с фиксированным содержанием свободного Са (pCa=2,45), а затем – с добавлением CaCl2 и ЭДТА (хелатора кальция).

6.3. Для оценки влияния фибриногена на агрегатные свойства эритроцитов кровь одновременно отбирали в две пробирки: с использованием антикоагулянта и без него. Степень агрегации эритроцитов оценивали при ресуспендировании в плазме и сыворотке (дефибринированной плазме).

6.4. Увеличение внутриклеточного пула кальция достигалось либо стимуляцией его входа (с использованием ионофора А23187, тромбина, фторида натрия), либо ингибированием кальциевого насоса (инкубацией с ванадатом натрия, трифторперазином и стауроспорин агликоном).

6.5. С целью исследования вовлеченности Са-активируемых калиевых каналов в процесс агрегатообразования эритроцитов в среду (аутоплазму) вводили 2,5 мМ ВаCl2, который устраняет Гардошэффект (Kaestner L., Bernhardt I., 2002).

6.6. Энергодефицитное состояние эритроцитов моделировали следующим образом: 1) хранением крови при комнатной температуре в течение 2 часов и 2) инкубацией эритроцитов в течение 1,5 ч при 37С в растворах а) йодацетамида; б) 2-дезокси-D-глюкозы. В качестве контроля использовали эритроциты, инкубировавшиеся в тех же условиях (1,5 ч при 37С) в физиологическом растворе.

7. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных материалов, включая корреляционный анализ, проводили на РС IBM, с использованием программы Statistica v5.5A и диалоговой статистической системы Stadia. За уровень статистически значимых принимали изменения при р<0,05.

Поскольку гемореологические параметры не всегда соответствуют нормальному распределению (Stuart J., 1985), в ряде случаев при оценке статистической значимости различий использовали непараметрические критерии.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»