WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

мод (t) = (1- exp(- b t)) +, (9), a i i i D k [ND ] Эфф i где a = P, b = K i i i i Эфф K i При этом величина Pi соответствует числу атомов H, обменивающихся с iтым набором одинаковых, с точки зрения достигаемой точности измерения, констант скорости. Количество наборов кинетических параметров (ai,bi) в модельном выражении (9) определялось из адекватности описания экспериментальных данных выбранной зависимостью в пределах экспериментальных ошибок. Критерием такой адекватности является соответствие величины минимального значения функционала при заданном числе наборов (ai, bi):

эксп N - мод(tn ), n F(ai,bi )= (10) n=1 n числу точек на экспериментальной зависимости – N. В уравнении (10) n соответствует измеренному опытным путем среднеквадратичному отклонению экспериментальных результатов от среднего значения величины эксп(t) при заданном постоянном t.

Рис. 2. Зависимости (t) для 1.протонированных ионов гистидина, полученные при разных давлениях 1.p, мкбар 36.6 дейтерирующей смеси в 29.реакторе.

24.0. 21. 20. 19.0.t, мс Оценка чувствительности выбранной методики при разрешении скоростей протекания H/D-обмена на разных реакционных центрах показывает, что порог такого разрешения при величинах n, достигаемых в нашей работе, соответствует константам скорости химической реакции, которые различаются примерно в четыре раза.

Глава 4. Экспериментальные результаты и их обсуждение. Приведены экспериментальные данные по исследованию кинетики химических процессов, протекающих при взаимодействии ионов девяти аминокислот (Ala, Asp, Arg, Glu, His, Ile, Lys, Pro, Tyr) и трех полипептидов (лейцинэнкефалин, грамицидин S, пептид HR2) с молекулами ND3. Предложена схема образования стабильных ион-молекулярных комплексов ионов семи аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr, Pro, His) с молекулами дейтероаммиака, наблюдаемых в полученных масс-спектрах. На основании предложенной схемы выведены выражения для аппроксимации экспериментальных зависимостей относительной интенсивности масс-спектральных пиков комплексов от времени контакта. С использованием полученных выражений определены константы скорости реакций комплексообразования для пяти аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr). Приведены результаты обработки масс-спектральных линий с помощью методики, описанной выше, с целью получения величин констант скорости H/D-обмена, специфичных для индивидуальных активных атомов.

4.1 Кинетика образования нековалентносвязанных комплексов ионов аминокислот с NDПомимо продуктов H/D-обмена протонированных ионов аминокислот и полипептидов в экспериментально полученных масс-спектрах наблюдались пики, соответствующие по M/z устойчивым ион-молекулярным комплексам протонированных аминокислот с ND3 (рис. 3).

3.DDDD1.0.156.0 156.5 157.D1 DDD5 DD134 136 138 DAspH+ 4 152 156 [AspH•ND3]+ 130 135 140 145 150 155 M/z Рис. 3. Интенсивности дейтерированных ионов (Asp+H+) и стабилизированных нековалентносвязанных комплексов этих ионов с молекулами ND3 (пики продуктов со степенью дейтерирования i и соответствующие им комплексы обозначены на рисунке символами Di). Масс-спектр, представленный в качестве примера, получен при проведении исследования H/D-обмена в ионах (Asp+H+), концентрация ND3 [ND3] = 2.21012 см-3, время реакции t = 8.3 мс.

Была предложена схема процессов, приводящих к появлению массспектральных линий комплексных ионов аминокислот с дейтероаммиаком:

k+ A+ + NH3 A NH3+* A NH3+* k + NHA+ (11) kS * A NH3+* + M A NH3+ + M k * A NH3+ + M A NH3+* + M В представленной схеме A+ - это ион аминокислоты, A·NH3+ - комплексный ион. В качестве M, как предполагалось первоначально, выступают степени свободы молекул буферного газа, с которыми происходят процессы обмена энергией, приводящие к стабилизации или возбуждению комплексных ионов.

Из решения системы дифференциальных уравнений, соответствующих механизму химических реакций (схема (11)) получено выражение, Количество ионов, тыс.

описывающее динамику изменения относительных интенсивностей массспектральных линий стабильных комплексов, исходя из условия квазиравновесности для концентрации возбужденных комплексов:

kSk+[NH3] 1- exp- kSk+[NH3] + k-k [M ]t. (12) IANH (t)= + kSk+[NH3] + k-k k- + kS[M ] 0.Рис. 4. Зависимости относительной интенсивности 0.нековалентносвязанных комплексов протонированных 0.p, мкбар ионов Asp с ND3 ( I ) от 38.ANH0. 32.времени реакции, полученные 25.0.0 при разных давлениях.

0 2 4 6 t, мс Из аппроксимации наблюдаемых временных зависимостей относительной интенсивности масс-спектральных линий комплексов (рис. 4) выражением (12) найдены значения параметра kSk+[M ][NH3] eff K = (13) k- + kS[M ] для ионов пяти аминокислот: Ala, Asp, Glu, Ile и Tyr при нескольких давлениях. Зависимости Keff для Asp, Glu и Ile оказались линейными по давлению (рис. 5). Для остальных ионов аминокислот соответствующие комплексы получались в очень малых количествах, и данных, на основании которых можно было бы сделать определенные утверждения о характере таких зависимостей, недостаточно. Исходя из наблюдающихся зависимостей Keff от p, имеющих линейный характер, предложен механизм комплексообразования, при котором в качестве третьего тела - M (схема(11)) участвуют внутренние степени свободы самих комплексов. Предположение о механизме внутренней диссипации избыточной энергии в ион-молекулярных комплексах сделано на основании того, что в противном случае зависимости Keff должны быть квадратичны по давлению.

A I Все полученные экспериментальные зависимости Keff от давления были аппроксимированы выражениями линейной регрессии, и с учетом уравнения (2) были рассчитаны величины эффективных констант комплексообразования для ионов аминокислот Asp, Ala, Glu, Ile и Tyr – KC.

Полученные величины сведены в табл. 1.

Asp Glu Рис. 5. Зависимости Keff от Ile 200 давления в реакторе, полученные для ионов аминокислот Asp, Ile и Glu.

18 24 30 36 p, мкбар Таблица 1. Эффективные константы скорости комплексообразования протонированных аминокислот с ND3.

Аминокислота KC1011, см3с-Asp 14.5±0.Ala 2.0±0.Glu 4.1±0.Ile 8.6±0.Tyr 9.1±0.4.2 Кинетика H/D-обмена в ионах аминокислот Полученные зависимости (t) для всех исследованных протонированных ионов аминокислот в пределах погрешностей экспериментальных измерений удовлетворительно описываются уравнением:

мод(t)= a(1- exp(- bt)) +. (14) Правильность такого описания подтверждается соответствием величины минимального значения функционала (10) числу экспериментальных точек для всех исследованных аминокислот.

Кривые (t) для всех аминокислот были аппроксимированы модель- ной зависимостью (14). Исходя из величин параметров a и b (уравнение (14)), eff -K, с полученных при разных давлениях дейтерирующей смеси, и с учетом величины максимально наблюдаемой степени H/D-обмена – P, для всех аминокислот были рассчитаны величины констант KD (уравнение (9)):

D D K = k, где kD – константа скорости H/D-обмена в ионе аминокислоты, усредненная по всем активным атомам водорода, принимающим участие в наблюдаемом процессе. Рассчитанные значения KD представлены в табл. 2. Полученные величины близки к величинам центроспецифичных констант скорости H/Dобмена, которые приводятся другими авторами.

Таблица 2. Эффективные константы скорости H/D-обмена и энергии сродства к протону исследованных аминокислот.

PA, KD1010, Аминокислота P ккал моль-1 см3 с-Ala 4 215.5 2.35±0.Asp 5 217.2 3.0±0.Glu 5 218.2 1.6±0.Ile 4 219.3 4.0±0.Pro 3 220.0 1.7±0.Tyr 4 221.3 3.0±0.His 4 236.1 2.9±0.Lys 5 238.0 0.8±0.Arg 2 251.2 0.7±0.В некоторых работах указывается на возможность корреляции скорости H/D-обмена с разностью в энергиях сродства к протону между Дейтерирующим агентом и ионом аминокислоты. В связи с этим значения констант скорости KD (табл. 2) были отложены от соответствующих величин разностей в энергиях сродства к протону, PA, между аммиаком ( PAND =ккал моль-1) и ионом аминокислоты (табл. 2). Результат представлен на рис.

6.

Ala Рис. 6. Значения KD, отло Asp 4.женные от соответствующих Glu Ile значений PA для протони Pro рованных аминокислот.

3. Tyr His Lys Arg 1.0.10 20 30 PA, ккал моль-Как видно из рис. 6, аминокислоты Lys и Arg, обладающие самыми большими величинами PA, имеют наименьшие значения KD. В аминокислоте His скорость H/D-обмена сильно превышает величину, ожидаемую на основании величины ее энергии сродства к протону. Повидимому, высокая скорость реакции H/D-обмена в ионе His объясняется тем, что реакция протекает через мостиковый водородносвязанный комплекс, образованный молекулой ND3 между атомами азота амино- и имидазольной функциональных групп (рис. 7).

O O Рис. 7. Реакция H/D-обмена в HHD N CH C OH D N CH C OH мостиковом комплексе, CHCHD2N D2N образованном ионом His с H N H N молекулой ND3.

NH NH 4.3 Кинетика H/D-обмена в ионах полипептидов При численной обработке экспериментальных результатов исследования кинетики H/D-обмена в ионах полипептидов возникают неопределённости в установлении максимальной степени дейтерирования, характерной для данного иона полипептида вследствие более сложного характера изотопных распределений этих ионов, чем у протонированных аминокислот. Поэтому точные числа активных атомов H (обозначение Pi в уравнении (9)), участвующих в реакции H/D-обмена в ионах полипептидов, D -K 10, см с не определялись. Таким образом, полученные для протонированных полипептидов константы скорости реакции имеют физический смысл суммарной скорости H/D-обмена активных атомов i-той группы, обменивающихся с неразличимым с точки зрения погрешности измерений скоростями, при единичной концентрации ND3.

Из уравнения (9) следует связь между определяемым из эксперимента произведением aibi и кинетическими параметрами реакции H/D-обмена:

aibi = kiD[ND3]Pi. (15) Выражение, стоящее справа от знака равенства, имеет смысл скорости обмена i-той группы атомов H при заданной постоянной концентрации молекул ND3. Исходя из линейной зависимости этого выражения от концентрации ND3, было найдено значение константы скорости реакции H/D-обмена i-той группы активных атомов H: Ki = kiDPi Далее величину Ki использовали в качестве сравнительной характеристики реакционной активности независимых центров протекания H/D-обмена в ионах полипептидов. Значения Ki, полученные в работе для всех исследованных форм ионов полипептидов, сведены в табл. 3.

Таблица 3. Константы скорости H/D-обмена в реакционных центрах ионов полипептидов Заряд иона в Полипептид элементарных K11010, см3с-1 K21011, см3с-единицах +2 1.7±0.1 1.6±0.Грамицидин S +1 0.016±0.001 --- Лейцин+1 1.5±0.1 ~0.Энкефалин Пептид HR2 +2 1.4±0.1 --- В двухзарядном ионе грамицидина S ([GS+2H]+2) обнаружено два вида активных атомов H, различающихся по скорости протекания для них реакции H/D-обмена. Из сравнения масштаба H/D-обмена в каждой из двух групп кинетически эквивалентных атомов H в [GS+2H]+2 видно, что концентрация атомов, участвующих в реакции с меньшей скоростью, выше (рис. 8).

Y(t)=a2(1-exp(-b2t)) a) Рис. 8. Оценка относительного содержания 1.атомов H, H/D-обмен Y(t)=a1(1-exp(-b1t)) которых описывается b) 0.6 кинетическими параметрами:

a) (a1,b1) и b) (a2,b2) в ионах [GS+2H]+0.t, мс В однозарядном ионе грамицидина S ([GS+H]+) наблюдается более медленная скорость реакции H/D-обмена по сравнению с [GS+2H]+2 (табл. 3).

По-видимому, это свидетельствует о том, что в результате кулоновских сил, возникающих между двумя положительными зарядами, иону [GS+2H]+соответствует более развёрнутая форма, что приводит к увеличению интенсивности H/D-обмена. В [GS+H]+ такое взаимодействие отсутствует.

Заряд иона при этом сильнее стабилизирован за счет формирования водородных связей, вследствие чего доступ молекул ND3 к подвижным атомам H затруднен.

Рис. 9. Зависимости (t) 2.полученные для [Leup, мкбар Enk+H]+ при 35. 39.максимальных давлениях дейтерирующей смеси 2.1.t, мс В ионе лейцин-энкефалина ([Leu-Enk+H]+) также обнаружено две группы атомов H, участвующих в реакции H/D-обмена с разными скоростями. Так как константы скорости реакции в этих группах Y различаются на три порядка величины, то на зависимости (t), построенной от lnt (рис. 9), отчётливо возникают дополнительные точки перегиба.

В ионе полипептида HR2 групп активных атомов H, участвующих в реакции H/D-обмена с разными скоростями, выделено не было (табл. 3).

Выводы 1. Разработана методика численной обработки масс-спектров протонированных аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе их взаимодействия с дейтерирующим агентом. Методика применена для получения информации о кинетике реакций H/D-обмена в независимых реакционных центрах молекулярных ионов девяти аминокислот и трех полипептидов. Учтено естественное изотопное распределение и реакция обратного обмена.

2. Определены ионные подвижности в электрическом поле ионов девяти аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Tyr, Lys), а также одно- и двухзарядных ионов грамицидина S, однозарядного иона лейцин-энкефалина и двухзарядного иона полипептида HR2.

3. С использованием радиочастотного квадруполя с продольным электрическим полем в качестве химического реактора и орто-ВПМС в качестве детектора исследованы процессы комплексообразования протонированных аминокислот с молекулами ND3, протекающие параллельно процессам H/Dобмена. Для семи ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr, Pro, His) установлено образование ион-молекулярных комплексов с молекулами ND3.

Для пяти ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr) определены константы скорости комплексообразования. На основании зависимости кинетики комплексообразования от давления предложен механизм стабилизации комплексов через диссипацию избыточной энергии на внутренние степени свободы самого комплекса 4. Исследована кинетика реакций H/D-обмена ионов девяти аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Tyr, Lys). Определены эффективные константы скорости H/D-обмена, величины которых находятся в диапазоне от 710-11 (для Arg) до 410-10 см3с-1 (для Ile). Проанализирована связь констант скорости H/Dобмена с разностями в энергиях сродства к протону реагентов.

5. Исследована кинетика реакций H/D-обмена в газовой фазе ионов полипептидов GS, Leu-Enk и HR2 и определены эффективные константы скорости, соответствующие групповому обмену кинетически эквивалентных активных атомов H. Установлено, что в [GS+2H]+2 присутствует два вида активных атомов H, различающихся по реакционной способности на порядок.

Установлено, что в [Leu-Enk+H]+ присутствует также два вида активных атомов H, различающихся по реакционной способности на три порядка. Для иона [HR2+2H]+2 различающихся констант скорости не выявлено.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»