WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ЧУДИНОВ Алексей Владимирович МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ДЕЙТЕРОВОДОРОДНОГО ОБМЕНА ИОНОВ БИООРГАНИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ С ДЕЙТЕРОАММИАКОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАДИОЧАСТОТНОГО СЕГМЕНТИРОВАННОГО КВАДРУПОЛЯ В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ИОННОГО РЕАКТОРА 01.04.17 – химическая физика, в том числе физика горения и взрыва

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Черноголовка 2007 г.

Работа выполнена в Филиале Института энергетических проблем химической физики РАН в лаборатории «Масс-спектрометрия в энергетике и экологии»

Научный консультант: доктор физико-математических наук Зеленов Владислав Валерьевич

Официальные оппоненты: кандидат физико-математических наук Сурин Алексей Константинович доктор физико-математических наук Морозов Игорь Иллиодорович

Ведущая организация: Институт проблем химической физики РАН

Защита диссертации состоится «»_2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.112.01 при Институте энергетических проблем химической физики РАН по адресу: 119334 Москва, Ленинский проспект, 38, корпус 2, ИНЭПХФ РАН, актовый зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН

Автореферат разослан «»_2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.112.01 кандидат химических наук Николаева М.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность:

1. Перспектива расширения аналитических возможностей метода массспектрометрии, как инструмента для изучения особенностей газофазной конформационной структуры биологических ионов.

2. Информация об устойчивых конформационных состояниях биомолекул в газовой фазе имеет как фундаментальную, так и практическую ценность.

Сюда можно включить:

• изучение влияния водной среды на процесс организации и функционирования биологических макромолекул, • уточнение природы внутримолекулярных взаимодействий, ведущих к формированию нековалентных структур в биологических системах.

3. Потребность в определении мест селективного протонирования в газофазных ионах белков и полипептидов для более глубокого понимания механизмов перехода таких ионов в вакуум в современных источниках ионизации: MALDI и ESI.

Целью настоящей работы является:

Исследование возможности использования сегментированного радиочастотного квадруполя, расположенного в атмосферном интерфейсе времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов, в качестве ион-молекулярного реактора для изучения кинетики реакций H/Dобмена в биоорганических ионах.

Для достижения поставленной цели были сформулированы задачи:

• Разработка методики численной обработки временной последовательности экспериментально полученных масс-спектров дейтерированных продуктов для вычисления кинетических параметров реакций изотопного обмена.

• Реализация экспериментального метода исследования, включая:

a) Определение величин подвижности ионов аминокислот и полипептидов в продольном электрическом поле сегментированного радиочастотного квадруполя.

b) Исследование кинетики H/D-обмена ряда биомолекулярных ионов с дейтерированным аммиаком внутри сегментированного радиочастотного квадруполя при задании времени контакта этих ионов с газом-реагентом напряженностью продольного электрического поля и последующим детектированием ионов-продуктов времяпролетным массспектрометром с ортогональным вводом ионов.

Основные защищаемые положения:

• Методика численной обработки масс-спектров молекулярных ионов аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе протекания процесса H/Dобмена в этих ионах.

• Механизм стабилизации ион-молекулярных комплексов ионов аминокислот с молекулами дейтероаммиака через диссипацию избыточной энергии на внутренних степенях свободы этих комплексов.

• Эффективные константы скорости реакции H/D-обмена в ионах аминокислот, усредненные по всем наблюдаемым процессам H/D-замещений и находящиеся в диапазоне ~10-11-10-10 см3с-1, при использовании дейтерированного аммиака в качестве дейтерирующего агента.

• Разрешение групп активных атомов водорода, участвующих в реакциях H/D-обмена с разными скоростями, в ионах грамицидина S и лейцинэнкефалина.

Научная новизна:

• Предложена оригинальная методика расчета кинетических параметров H/D-обмена, которая использует связь наблюдаемых интенсивностей массспектральных линий с концентрацией активных центров исходного ионареагента. Разработанный подход применим для сложных биоорганических молекул, для которых изотопное распределение является неразрешенным.

• Продемонстрированы возможности сегментированного радиочастотного квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора для исследования H/Dобмена в биомолекулярных ионах.

Научная и практическая ценность:

• Разработанный метод определения кинетических параметров процесса H/D-обмена в сложных биоорганических ионах является универсальным. Он применим для широкого круга ионов биомолекул и газов-реагентов.

• Сегментированный радиочастотный квадруполь, предлагаемый в качестве молекулярно-ионного реактора для изучения H/D-обмена, может применяться как атмосферный интерфейс во времяпролетных массспектрометрах с целью расширения их аналитических возможностей.

Личный вклад автора:

Автором разработана численная методика для исследования кинетики реакций изотопного обмена при масс-спектрометрическом детектировании продуктов реакции. Автор непосредственно участвовал в обосновании, постановке и проведении всех экспериментов, их интерпретации и обобщении полученных результатов.

Апробация работы:

Результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях:

Международная конференция “Desorption-2004”, Санкт-Петербург, Россия, 2004; 2-я Международная семинар-школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 2004, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых); Международная конференция американского массспектрометрического общества, Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, San Antonio, USA, 2005; I Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы», Москва, 2005; Конференция «Научные школы Черноголовки - молодежи», Черноголовка, 2006; 3-я Международная конференция–школа «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии», Звенигород, 2007, (докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых ученых).

Объем и структура диссертации:

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 110 страниц, включая 42 рисунка и 7 таблиц. Список литературы содержит наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснованы выбор и актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная новизна и практическая значимость.

Глава 1. Литературный обзор. Сделан обзор по результатам экспериментов, подтверждающих возможность существования устойчивых конформационных состояний у биомолекулярных ионов в газовой фазе. Дано краткое описание методов исследования газофазных конформационных структур белковых молекул с использованием массспектрометрии. Сделан детальный обзор по исследованию конформационных состояний молекулярных ионов белков и полипептидов в газовой фазе с использованием реакций газофазного H/D-обмена с последующим масс-спектрометрическим детектированием образующихся продуктов. Описаны преимущества и особенности методики, используемой в диссертационной работе.

Глава 2. Методика проведения экспериментов. Описана экспериментальная установка. Приведен список используемых реактивов. Описана процедура проведения экспериментов и подходы, используемые при изучении кинетики химических процессов методом времяпролетной массспектрометрии.

Экспериментальная установка представляет собой времяпролетный масс-спектрометр с ортогональным вводом ионов (о-ВПМС). Ионы аминокислот и полипептидов получают в источнике ионизации электрораспылением. В качестве молекулярно-ионного реактора используется сегментированный радиочастотный квадруполь (RFQ) (рис. 1), находящийся во второй ступени дифференциальной откачки атмосферного интерфейса о-ВПМС. Ионы попадают внутрь реактора из первой ступени дифференциальной откачки атмосферного интерфейса о-ВПМС (рис. 1(1)).

Под действием эффективного потенциала радиочастотного поля (рис. 1(7)) и соударений с молекулами газа ионы стягиваются к оси RFQ. Под действием постоянного продольного электрического поля (рис. 1(6)) ионы двигаются с постоянной дрейфовой скоростью в атмосфере буферного газа ко входу во времяпролетный масс-анализатор. Основной составляющей буферного газа является N2 газовой завесы источника ESI. Время нахождения ионов внутри RFQ определяется формулой:

t = l E, (1) где l=17 см длина квадруполя, E – напряженность продольного электрического поля, – подвижность исследуемых ионов в электрическом поле.

Измерение подвижности в электрическом поле ионов девяти аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Tyr, Lys), а также двух- и однозарядных ионов грамицидина S, однозарядных ионов лейцинэнкефалина и двухзарядных ионов полипептида HR2 проводилось непосредственно в процессе выполнения работы по методике, разработанной ранее. В диссертации приводится описание этой методики и таблица с полученными значениями ионных подвижностей.

Рис. 1. Схема молекулярноионного реактора: 1 – протонированные ионы полипептидов; 2 - баллон с дейтерирующей смесью; 3 - игольчатый вентиль для подачи дейтерирующей смеси в реактор; 4 - датчик давления газа в реакторе; 5 – радиочастотный квадруполь (RFQ);

6 – принципиальная электрическая схема подачи постоянного электрического поля на RFQ; 7 – принципиальная электрическая схема подачи радиочастотного электрического поля на RFQ; 8 – орто-время-пролетный масс-спектрометр.

Для проведения реакций H/D-обмена внутрь RFQ через игольчатый вентиль рис. 1(3) подавалась дейтерирующая смесь, представляющая собой ND3, разбавленный в N2. Концентрация дейтерирующего агента в реакторе рассчитывалась по формуле:

[ND3] = ( p - p0 )nL, (2) где - содержание ND3 в дейтерирующей смеси в долях; p- давление в реакторе, бар; p0 - остаточное давление воздуха в реакторе в отсутствие подачи дейтерирующей смеси, бар; nL- число Лошмидта ( nL = 2.441019 см-бар-1).

Все расчеты кинетики реакций в работе производили, пренебрегая переносом ионов вдоль оси RFQ за счет продольной диффузии на основании малости его вклада, что следует из выполнения неравенства:

4kD /(E)2 < 0.1 (3) где D – коэффициент диффузии, а k – эффективная константа реакции.

Неравенство (3) остаётся справедливым практически во всех случаях.

Глава 3. Модельное описание кинетики H/D-обмена в протонированных ионах аминокислот и полипептидов. Выведено уравнение, связывающее наблюдаемую зависимость изотопного распределения относительных интенсивностей в масс-спектральных линиях исследуемого иона с изменением содержания атомов дейтерия (D) в независимых реакционных центрах. Предложена кинетическая модель обратимого протекания реакций H/D-обмена и на её основе предложен метод расчета кинетических параметров H/D-обмена. Оценена чувствительность этого метода.

Величина сдвига изотопного распределения в результате реакции H/D-обмена может быть выражена через относительные интенсивности массспектральных пиков изотопного распределения иона в виде:

(t)= j I (t), (4) j j где Ij – относительная интенсивность j-го пика. Иону, содержащему только самые легкие изотопы в уравнении (4), присваивается порядковый номер j=0.

Здесь и далее мы будем предполагать равенство относительных интенсивностей пиков в масс-спектре их относительным концентрациям в долях от суммарной концентрации наблюдаемых ионов-продуктов:

I (t)=1.

j j Процесс H/D-обмена представляет собой сумму химических реакций, приводящих к накоплению атомов D в независимых реакционных центрах ионов биомолекул:

H (t)= n (t)+, (5) n i i i где niH - количество активных атомов в i-том независимом центре, ni(t) – относительная концентрация атомов D в i-том центре в момент времени t, параметр введен для учета природных изотопов, присутствующих в исходных ионах (=(0)). Каждая функция ni(t) является решением системы дифференциальных кинетических уравнений, описывающих кинетику изменения относительной концентрации атомов D в i-том центре по всем возможным продуктам.

Для больших молекул белков в высоких зарядовых состояниях пики отдельных ионов в изотопном распределении могут быть неразрешимы. В этом случае предлагается метод вычисления величины сдвига изотопного распределения с использованием следующего выражения:

Mmax / z M I(t,M / z)d(M / z) Mmin / z (t)= - Mmin, (6) Mmax / z I(t,M / z)d(M / z) Mmin / z где I(M/z) – интенсивность масс-спектра в точке с абсциссой M/z, величина Mmin соответствует молекулярной массе иона, содержащего только самые легкие изотопы, а Mmax – самые тяжелые. В диссертационной работе приводится доказательство справедливости уравнения (6).

Для численной обработки экспериментальных данных по кинетике H/D-обмена в работе использовано аналитическое выражение, следующее из рассмотрения реакции замещения каждого отдельного атома H на атом D, как независимого процесса. Уравнение (5) с точки зрения предлагаемой модели будет иметь вид:

D k [ND ] Эфф i (t)= (1- exp(- K t))+, (7) i Эфф i K i где KiЭфф = kiD[ND3] + (1- )kiH[ND3] + kiФ[H]. (8) В уравнениях (7) и (8): – относительное содержание D в ND3 (0<<1); kiD, kiH – константы скорости прямой и обратной реакций H/D-обмена, происходящих в результате взаимодействия исследуемых ионов с молекулами аммиака, для каждого i-того атома H. Для учета возможной обратной реакции H/D-обмена, происходящей в результате взаимодействия с водородсодержащими примесями в реакторе, в уравнении (8) присутствует член kiФ[H].

На основании уравнения (7) при анализе полученных в работе зависимостей эксп(t), пример которых представлен на рис. 2, использовалось выражение:

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»