WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

3.1. Влияние комбинированного применения агонистов PPAR на экспрессию COX-Так как эффекты взаимодействия изоформ PPAR наиболее ярко проявляются при комбинированном применении их синтетических агонистов, то мы изучили ЛПС-стимулированные астроциты, обработанные различными комбинациями синтетических PPAR агонистов. Получено, что после совместной обработки клеток PPAR и PPAR агонистами уровень экспрессии COX-2 не менялся по сравнению с клетками обработанными только PPAR агонистом (Рис. 9; столбцы 2 и 3). Совместная обработка клеток PPAR и PPAR агонистами приводила к 3-х кратному увеличению экспрессии (Рис. 9; столбцы 1 и 4), однако это увеличение снималось при добавлении агониста PPAR (сравнение столбцов 4 и 6 на Рис. 9). С использованием метода иммуноблотинга показано, что данные по количеству мРНК соответствуют данным по количеству белка. Таким образом, показано, что взаимодействия между изоформами PPAR вносят значительный вклад в регуляцию экспрессии COX-2, ключевого фермента синтеза простагландинов в активированных астроцитах.

Рис. 9. Комбинации агонистов PPAR модулируют экспрессию COX-2.

Астроциты предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистами росиглитазоном (Рос) (20мкМ) и циглитазоном (Циг) (40 мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч.

Экспрессия COX-2 определялась с помощью ПЦР в реальном времени.

Экспрессия COX-2 в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

3.2. Центральная роль PPAR в регуляции ЛПС-индуцированной экспрессии COX-Поскольку мы показали, что агонист PPAR росиглитазон приводит к индукции экспрессии PPAR, то логично было предположить, что этот эффект может быть причиной наблюдаемого потенцирования экспрессии COX-2 росиглитазоном. Для доказательства этой гипотезы мы использовали астроциты с нокдауном PPAR. На этих клетках были изучены эффекты комбинированного применения PPAR агониста росиглитазона с PPAR агонистом L-165041. Получено, что хотя «базовый» уровень экспрессии COX-2 в ЛПС- стимулированных астроцитах не изменяется (Рис. 10; столбцы 1 и 2), однако нокдаун PPAR снимает эффект как росиглитазона, так и комбинации росиглитазона с L-165041 (Рис. 10; сравнение столбцов 5,6 и столбцов 3,4). Эти результаты позволяют сделать вывод, что для проявления эффекта росиглитазона на экспрессию COX-2 необходимо наличие активного PPAR. Полученные результаты позволяют предположить, что роль других изоформ PPAR сводится к изменению количества и активности изоформы PPAR.

Рис. 10. Ключевая роль PPAR в модуляции экспрессии COX-2. Как контрольные, так и астроциты с нокдауном PPAR предынкубировались с PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Экспрессия COX-определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия COX-2 в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз.

* p<0.05.

Для проверки этой гипотезы мы трансфецировали астроциты плазмидой, сверхэкспрессирующей PPAR и изучили влияние различных комбинаций агонистов PPAR на экспрессию COX-2 в данной клеточной модели. Обнаружено, что увеличение экспрессии PPAR приводит к увеличению уровня экспрессии COX-2 в 2 раза. Добавление агониста PPAR L-165140 увеличивает этот уровень еще в 2 раза, причем эффект становится независимым от добавления агонистов PPAR, или PPAR, то есть можно предположить, что клетки при избытке PPAR становятся нечувствительными к регуляции экспрессии COX-2 агонистами PPAR и PPAR. Для доказательства этой гипотезы, мы изучили эффекты агонистов PPAR и PPAR на астроцитах, сверхэкспрессирующих PPAR, но с нокдауном PPAR или PPAR. Было получено, что нокдаун PPAR или PPAR не влиял на уровень COX-2 в таких астроцитах при обработке их L-165140. Эти данные подтверждают, что PPAR играет центральную роль в потенцировании экспрессии COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС, а роль остальных изоформ PPAR сводится к модуляции экспрессии PPAR. Проведенные эксперименты позволили предложить следующую схему взаимодействия изотипов PPAR при регуляции ЛПС-индуцированной экспрессии COX-(Рис.11): PPAR активирует (Рис.11; путь 1), а PPAR ингибирует (Рис.11;

путь 2) экспрессию и активность PPAR. Активация PPAR приводит к потенцированию ЛПС-индуцированной экспрессии COX-2 (Рис.11; путь 3).

При этом PPAR увеличивает экспрессию и активность PPAR (Рис.11; путь 4), то есть описанная система способна к терминации экспрессии COX-2.

Рис. 11. Схема взаимодействия изотипов PPAR при регуляции экспрессии COX-2. 1) PPAR активирует PPAR;2) PPAR супрессирует экспрессию и активность PPAR;3) Активация PPAR приводит к увеличению экспрессии COX-2; 4) Активация PPAR приводит к активации PPAR.

3.3. Изучение физиологической значимости росиглитазониндуцированной экспрессии COX-Обнаруженное влияние росиглитазона на экспрессию COX-исключительно важно в свете предполагаемого использования синтетических PPAR агонистов как нейропротективных средств. Поэтому нами были проведены исследования по влиянию росиглитазона на выброс физиологически активных медиаторов воспаления- простагландинов. Был разработан метод количественного определения концентрации простагландинов с помощью метода масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. В ходе работы было показано, что концентрации всех изучаемых простагландинов при ответе астроцитов на ЛПС меняются согласованно с простагландином Е2, который является общепризнанным маркером воспаления. Поэтому далее активность полиферментной системы синтеза простагландинов оценивалась по уровню выбрасываемого астроцитами простагландина Е2, который измеряли иммуноферментным методом. Был показано, что стимуляция астроцитов ЛПС приводит к выбросу простагландина Е2, концентрация которого становится равной 1,1±0,нг/мл, а росиглитазон PPAR увеличивает этот выброс до концентрации 2,1±0,09 нг/мл. Действие росиглитазона снимается в присутствии антагониста PPAR, который снижает уровень простагландина Е2 до 0,9±0,нг/мл. Таким образом, обнаруженная росиглитазон-индуцированная экспрессия COX-2 является физиологически значимой.

4. Влияние агонистов PPAR на экспрессию цитозольной и секреторной ФЛА2 в астроцитах, стимулированных ЛПС Важной характеристикой действия провоспалительных стимулов на астроциты является активация фосфолипазы А2 (ФЛА2) и высвобождение полиненасыщенных жирных кислот. ФЛА2 относится к классу PPAR лигандсинтезирующих ферментов. Известно, что в астроцитах при воспалении главную роль играют секреторная и цитозольная ФЛА2, а в литературе имеются указания на возможность регуляции секреторной и цитозольной ФЛА2 агонистами PPAR, но работ по изучению влияния всех трех изотипов PPAR на экспрессию ФЛА2 в не проводилось. Не было сведений и о регуляции ФЛА2 агонистами PPAR в астроцитах. Поэтому мы изучили влияние ЛПС на экспрессию секреторной и цитозольной ФЛА2.

Получено, что уровень экспрессии цитозольной ФЛА2 увеличивается в 2 раза к 16 ч инкубации астроцитов с ЛПС и далее остается на постоянном уровне (Рис. 12 А). Эти результаты согласуются с общепринятым представлением, что активация ФЛА2 на начальных этапах ответа на провоспалительные стимулы происходит за счет фосфорилирования уже существующего белка и лишь на более поздних этапах идет регуляция ее экспрессии. PPAR агонист росиглитазон приводил к росту уровня экспрессии цитозольной ФЛА2 начиная с 2 ч инкубации, который достигал максимального (троекратного по сравнению с ЛПС-стимулированными астроцитами) уровня к 4 часам. К 16 часам уровень цитозольной ФЛА2 не отличался от уровня цитозольной ФЛА2 в контрольных клетках (Рис. 12 A).

Нокдаун PPAR снимал эффекты росиглитазона (Рис. 12 A), что говорит о PPAR специфическом действии этого агониста. Аналогично исследовали эффекты PPAR и PPAR агонистов. Активация PPAR его агонистом L165041, приводит к увеличению уровня цитозольной ФЛА2 на всех сроках ЛПС стимуляции (2-24 часа). Показано, что агонист GW7647 через активацию PPAR приводит к значимому увеличению экспрессии цитозольной ФЛА2 после четырехчасовой ЛПС-стимуляции. Таким образом, все три изоформы PPAR принимают участие в модуляции ЛПСиндуцированного уровня экспрессии цитозольной ФЛА2.

Экспрессия секреторной ФЛА2 увеличивается в 3 раза после 4 ч стимуляции, к 16 ч возвращается к исходному уровню и не меняется в дальнейшем (Рис. 12 Б). Несколько другой тип воздействия оказывают PPAR на экспрессию секреторной ФЛА2. PPAR и PPAR агонисты не влияют на экспрессию секреторной ФЛА2 в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкM.

Обработка астроцитов росиглитазоном приводит к трехкратному увеличению уровня секреторной ФЛА2 после 2 часов стимуляции и к двукратному увеличению после 4 ч стимуляции ЛПС (Рис. 12 Б). К 16 ч уровень секреторной ФЛА2 в обработанных росиглитазоном клетках падает до уровня в контрольных клетках и остается постоянным вплоть до окончания измерений (24 часа стимуляции) (Рис. 12 Б). На клетках с нокдауном PPAR показано, что эффект росиглитазона является PPAR зависимым (Рис. 12 Б).

Таким образом, все три изоформы PPAR участвуют в регуляции экспрессии цитозольной ФЛА2 и только активация PPAR увеличивает уровень экспрессии секреторной ФЛА2, тем не менее PPAR не влияют на «базовый» ЛПС-индуцированный уровень экспрессии ФЛА2, а участвуют только в его потенцировании.

Рис. 12. Активация PPAR увеличивает экспрессию цитозольной (цФЛА2) и секреторной (сФЛА2) фосфолипаз А2. Контрольные астроциты, также как и астроциты с нокдауном PPAR предынкубировались с PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (5 мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 2, 4, 16 и 24 ч. Экспрессия цитозольной (цФЛА2) (А) и секреторной (сФЛА2) (Б) фосфолипаз А2 определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

5. Роль эндогенных лигандов PPAR, продуцируемых ФЛА2 и COX-2, в развитии воспалительного ответа Нами было показано, что PPAR участвуют в активации экспрессии PPAR лиганд-синтезирующих ферментов: ФЛА2 и COX-2, регулируют количество своих эндогенных лигандов при ответе на провоспалительный стимул. Для подтверждения наличия взаимосвязи между PPAR и их лигандсинтезирующими ферментами мы обрабатывали клетки ингибиторами ФЛА(MAFP и специфический ингибитор цитозольной ФЛА2), а также специфическим ингибитором COX-2 NS398. Получено, что ингибиторы не влияли на «базовый» уровень ЛПС-индуцированной экспрессии COX-2 (Рис.

13А, белые столбцы), однако снимали росиглитазон-индуцированную экспрессию COX-2 (Рис. 13 А, серые столбцы), то есть эндогенные лиганды, продуцируемые ФЛА2 и COX-2 играют важную роль в реализации эффекта росиглитазона. Агонистом PPAR восстанавливает уровень экспрессии COX-при всех обработках (Рис. 13 А), что указывает на то, что эндогенные лиганды в рассматриваемой системе являются лигандами PPAR. Можно предложить следующую схему, объясняющую взаимодействия PPAR и их лиганд-синтезирующих ферментов (Рис. 13 Б): провоспалительный стимул активирует COX-2 и ФЛА2, которые синтезируют простагландины и полиненасыщенные жирные кислоты; эти вещества являются эндогенными лигандами PPAR (Рис. 13 Б).

Рис. 13. Фосфолипазы А2 и COX-2 продуцируют эндогенные лиганды PPAR.

(А) Астроциты 10 мин предынкубировались с MAFP (5 мкМ), специфическим ингибитором цитозольной фосфолипазы цФЛА2инг (1 мкМ) и со специфическим ингибитором COX-2 NS398 ( мкМ). Далее клетки обрабатывались PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ). После 4 часов ЛПС стимуляции с помощью ПЦР в реальном времени измерялась экспрессия COX2. Экспрессия COX-2 в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

(B) При воздействии провоспалительного стимула фосфолипазы А2 выщепляют полиненасыщенные жирные кислоты из фосфолипидов (1); эти жирные кислоты являются субстратом для COX-2 (2), который превращает их в простагландины (3); и жирные кислоты и простагландины являются эндогенными лигандами PPAR (4), активация которого индуцирует экспрессию COX-2 (5) и ФЛА2 (6).

ВЫВОДЫ 1. Исследовано влияние синтетических агонистов ядерных рецепторов PPAR на экспрессию генов самих ядерных рецепторов PPAR,, и ферментов классов фосфолипаз А2 и циклооксигеназ. Показано, что синтетические агонисты изоформ PPAR влияют на экспрессию этих генов.

2. Изучена взаимосвязь между изоформами PPAR, и в астроцитах, стимулированных ЛПС. Показано, что PPAR увеличивает, а PPAR снижает уровень экспрессии и активность PPAR; PPAR увеличивает уровень экспрессии и активность PPAR.

3. Показано положительное влияние агонистов PPAR и отрицательное влияние агонистов PPAR на экспрессию COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Установлено, что механизм действия этих агонистов заключается в модуляции активности PPAR, который играет ключевую роль в регуляции экспрессии COX-2.

4. В результате исследования влияния ядерных рецепторов PPAR, и на экспрессию цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 в астроцитах, стимулированных ЛПС, установлено, что экспрессия цитозольной фосфолипазы А2 находится под положительным контролем PPAR, и, а экспрессия секреторной фосфолипазы Анаходится под положительным контролем PPAR.

5. Показано, что активность цитозольной фосфолипазы А2 и COX-необходима для PPAR-опосредованной регуляции экспрессии COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Установлено, что в данной системе эти ферменты продуцируют эндогенные лиганды PPAR.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Aleshin S, Grabeklis S, Hanck T, Sergeeva M, Reiser G. (2009).

Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-gamma positively controls and PPARalpha negatively controls cyclooxygenase-2 expression in rat brain astrocytes through a convergence on PPARbeta/delta via mutual control of PPAR expression levels. Mol Pharmacol. 76(2): 414-2. Каратассо Ю.О., Алёшин С.Е., Попова Н.В., Чистяков В.В., Сергеева М.Г., Варфоломеев С.Д. (2007). Количественный анализ простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот методом массспектрометрии с ионизацией электрораспылением. Массспектрометрия т.4, в. 3: 173-Тезисы конференций и статьи в сборниках:

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»