WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

На основании анализа литературных данных мы предположили, что лиганды одной изоформы PPAR, способны изменять экспрессию другой изоформы. Для проверки этой гипотезы мы проводили следующие эксперименты: астроциты предынкубировались в течение 10 минут с различными концентрациями GW7647 (PPAR агонист), L-165041 (PPAR агонист) и росиглитазона (PPAR агонист). Далее клетки стимулировали ЛПС, через 4 часа стимуляции из астроцитов выделяли тотальную РНК и с помощью ПЦР в реальном времени анализировали уровни экспрессии изоформ PPAR. Получено, что в астроцитах, стимулированных ЛПС, агонист PPAR GW7647 концентрационно-зависимо снижает экспрессию своего рецептора (Рис. 2А). При использовании 10 мкМ GW7647 уровень экспрессии PPAR снижается в два раза. Обработка астроцитов 10 мкМ агониста PPAR L-165041, приводит к двукратному увеличению уровня экспрессии PPAR. PPAR агонист росиглитазон не оказывал влияния на экспрессию PPAR изоформы (Рис. 2А), то есть экспрессия PPAR регулируется агонистами PPAR и PPAR. В аналогичных экспериментах было показано, что только синтетический агонист PPAR влияет на экспрессию PPAR и PPAR, увеличивая её. (Рис. 2Б,В). Таким образом, все три агониста способны влиять на экспрессию изоформ PPAR в астроцитах, стимулированных ЛПС. Полученные данные указывают на существование взаимосвязей между тремя изоформами PPAR на уровне их экспрессии в астроцитах, стимулированных ЛПС.

Рис. 2. Агонисты PPAR модулируют экспрессию изоформ PPAR. Астроциты обрабатывали указанными концентрациями PPAR (GW7647), PPAR (L-165041) и PPAR (Рос) агонистов, через 10 мин. клетки стимулировались ЛПС. Через 4 ч стимуляции экспрессия PPAR (A), PPAR (Б) и PPAR (В) определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

2.1. Влияние комбинаций агонистов PPAR на экспрессию PPAR,,.

Так как было показано, что агонисты PPAR способны менять уровни экспрессии изоформ этого семейства транскрипционных факторов, то можно предположить, что совместная обработка клеток агонистами нескольких изоформ PPAR будет приводить к синергетическим эффектам. Для проверки этого предположения мы предынкубировали астроциты с различными комбинациями PPAR агонистов, затем стимулировали клетки ЛПС и измеряли уровни экспрессии изоформ PPAR на уровне мРНК и белка. Добавление только L-165041 или росиглитазона не оказывало влияния на экспрессию PPAR, однако совместное добавление росиглитазона и L-165041 приводило к увеличению экспрессии PPAR (Рис. 3; столбец 3). Эффект совместного применения может быть объяснен тем, что росиглитазон увеличивает уровень экспрессии PPAR (Рис. 3; столбец 2), порог чувствительности клеток к действию PPAR агониста снижается, и он начинает действовать в меньших концентрациях.

Интересно, что PPAR агонист GW7647 не оказывает влияния на экспрессию PPAR, однако снимает росиглитазон-индуцированную экспрессию PPAR (Рис. 3; столбцы 2 и 4). Совместное добавление, всех трех агонистов приводит к максимальному падению экспрессии PPAR (Рис.

3; столбец 6). Это может объясняться тем, что в этих условиях экспрессия PPAR максимальна, а также имеется избыток его агониста GW7647, то есть активность PPAR также максимальна. Таким образом, комбинированное применение агонистов PPAR может приводить к сложным вторичным эффектам за счет модулирования уровней экспрессии их рецепторов.

Рис. 3. Комбинации агонистов PPAR модулируют экспрессию изоформ PPAR. Астроциты предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Экспрессия изоформ PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трёх раз. * p<0.05.

2.2. Росиглитазон индуцирует экспрессию PPAR через PPARопосредованный путь Агонисты PPAR могут действовать как через специфическую активацию PPAR, так и через неспецифические взаимодействия с другими мишенями в клетке. Для выяснения специфичности действия росиглитазона как PPAR агониста мы использовали циглитазон, который является агонистом PPAR, но имеет другую химическую структуру, а также антагонист PPAR GW9662.

Получено, что циглитазон оказывает такой же эффект, что и росиглитазон (Рис. 4). Предобработка клеток антагонистом GW9662 снимает индукцию экспрессии PPAR росиглитазоном или циглитазоном (Рис. 4). Эти результаты указывают на специфическое действие росиглитазона и циглитазона как PPAR агонистов. Для подтверждения этого предположения мы исследовали астроциты с нокдауном PPAR (Рис. 4). Полученные данные подтверждают, что росиглитазон увеличивает уровень экспрессии PPAR через активацию PPAR рецептора.

Рис. 4. Активация PPAR увеличивает экспрессию PPAR в астроцитах, стимулированных ЛПС. Астроциты предобрабатывались антагонистом PPAR GW(1 мкМ) в течение 10 мин или использовались астроциты с нокдауном PPAR.

Далее клетки обрабатывали PPAR агонистами росиглитазоном (Р) и циглитазоном (Ц) в концентрации 20 и 40 мкМ соответственно, затем астроциты стимулировались ЛПС.

Через 4 ч стимуляции экспрессия PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

2.3. PPAR агонист GW7647 снижает экспрессию PPAR через PPAR-опосредованный путь Агонисты PPAR также могут оказывать PPAR неспецифические эффекты, поэтому для доказательства того, что влияние GW7647 на экспрессию PPAR является PPAR- опосредованным процессом, мы получили астроциты с нокдауном PPAR. Добавление GW7647 к изучаемой системе не оказывало влияния на экспрессию PPAR в астроцитах с нокдауном PPAR (Рис. 5; столбец 6), что указывает на PPAR опосредованный эффект этого агониста. Более того, измерение уровней мРНК в ЛПС-стимулированных клетках показало, что нокдаун PPAR приводит к увеличению экспрессии PPAR в 2,5 раза (Рис. 5; столбцы 1 и 2).

Далее было показано, что изменение уровней мРНК PPAR коррелирует с изменениями количества белка PPAR. Таким образом, мы показали, что экспрессия PPAR находится под негативным контролем PPAR.

Рис. 5. Активация PPAR снимает увеличение экспрессии PPAR, вызванное активацией PPAR.

Контрольные астроциты, также как и астроциты с нокдауном PPAR предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение ч. Экспрессия PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени.

Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

2.4. PPAR агонист L-165041 увеличивает экспрессию и активность PPAR в астроцитах, стимулированных ЛПС, через PPAR- опосредованный путь Поскольку было получено, что экспрессия PPAR увеличивается только в астроцитах совместно обработанных росиглитазоном и L-165041, то есть в условиях активации, то мы предположили, что именно PPAR отвечает за увеличение уровня экспрессии PPAR. Для того, чтобы доказать наличие связи между PPAR и PPAR мы получили и исследовали астроциты с нокдауном PPAR. Действительно, в астроцитах, обработанных росиглитазоном и L-165041 совместно, нокдаун PPAR приводил к трехкратному снижению уровня экспрессии PPAR (Рис. 6А; столбцы 7 и 8).

Аналогичные результаты были получены и при измерении количества белка PPAR.

Для подтверждения ключевой роли PPAR в индукции экспрессии PPAR мы получили астроциты со сверхэкспрессией PPAR и провели их исследование. Показано, что избыток PPAR приводит к значительному увеличению уровня экспрессии мРНК PPAR в клетках, обработанных PPAR агонистом (Рис. 6Б; столбцы 3 и 4). Этот эксперимент доказывает, что PPAR является позитивным регулятором экспрессии PPAR. Поскольку нокдаун PPAR изоформы в контрольных клетках приводил к снижению экспрессии PPAR в астроцитах, обработанных росиглитазоном и L-165041 совместно (Рис. 6Б; столбцы 5 и 7), а сверхэкспрессия PPAR снимала этот супрессирующий эффект нокдауна PPAR (Рис. 6Б; столбцы 7 и 8), то можно сделать вывод, что роль PPAR агониста в увеличении экспрессии PPAR сводится к индукции экспрессии PPAR. Таким образом, наряду с позитивной регуляцией PPAR изоформой и негативной регуляцией PPAR изоформой, PPAR изоформа увеличивает экспрессию PPAR.

Рис. 6. Активация PPAR приводит к увеличению экспрессии PPAR.

Астроциты с нокдауном (А) или сверхэкспрессией (Б) PPAR предынкубировались с PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Экспрессия PPAR определялась с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

2.5. Взаимодействие изоформ PPAR на уровне модуляции их активности Взаимодействие между изоформами PPAR было обнаружено на уровне их количества. Тем не менее, известно, что количество транскрипционного фактора не обязательно согласуется с его активностью, поэтому для проверки наличия взаимодействия PPAR на уровне их ДНК-связывающей активности мы измерили активность PPAR в астроцитах, обработанных различными комбинациями PPAR агонистов. Показано, что при обработке астроцитов PPAR агонистом GW7647 совместно с PPAR агонистом росиглитазоном активность PPAR не изменялась, однако добавление L165041 к этим агонистам более чем в 4 раза увеличивало активность PPAR (Рис. 7А). Эти данные показывают, что PPAR увеличивает активность PPAR. Показано, что добавление росиглитазона в 2,5 раза увеличивает активность PPAR (Рис. 7Б), а комбинированная обработка астроцитов росиглитазоном и L-165041 приводит к увеличению активности PPAR в 5, раз (Рис. 7Б), то есть PPAR увеличивает активность PPAR. Эта индукция активности PPAR снимается агонистом PPAR (Рис. 7Б), что подтверждает негативную роль PPAR в регуляции PPAR. Таким образом, регуляция PPAR на уровне активности совпадает с их регуляцией на уровне экспрессии.

Рис. 7. Активность PPAR модулируется схоже с их экспрессией. Астроциты 10 мин предынкубировались с PPAR агонистом GW7647 (1 мкМ), PPAR агонистом L-165041 (1мкМ) и PPAR агонистом росиглитазоном (Рос) (20мкМ), затем клетки стимулировались ЛПС в течение 4 ч. Активность PPAR (A) и PPAR (Б) определялась с иммуноферментного набора. Активность PPAR в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

3. Влияние агонистов PPAR на экспрессию COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС Важной функцией астроцитов при развитии воспалительного ответа является синтез простагландинов. Ключевым ферментом синтеза простагландинов является циклооксигеназа. В астроцитах экспрессируются две изоформы COX (COX-1 и COX-2). В литературе имеются сведения о влиянии синтетических агонистов различных изоформ PPAR на экспрессию COX-2, однако они противоречивы и зависят от типа изучаемых клеток и параметров эксперимента. Поэтому мы исследовали возможность регуляции COX-1 и COX-2 синтетическими агонистами PPAR, и в астроцитах, стимулированных ЛПС.

Исследование динамики экспрессии COX показало, что уровень мРНК COX-2 начинает возрастать уже через 2 ч после ЛПС стимуляции, достигает максимума к 4 ч инкубации астроцитов с ЛПС, незначительно снижается к 16 ч и остается на этом уровне до 24 часов инкубации астроцитов с ЛПС.

Данные иммуноблотинга показали, что уровень белка COX-2 значительно возрастает к 4 ч ЛПС стимуляции и далее практически не растет. ЛПС приводит к незначительному падению уровня экспрессии COX-1 к 4 ч, далее этот уровень сохраняется. Хотя ранее таких исследований на астроцитах не проводилось, однако полученные результаты согласуются с общепринятыми представлениями о COX-1 как о конститутивно экспрессирующемся гене и о COX-2 как о ферменте, индуцируемом при воспалительном ответе.

При добавлении различных концентраций синтетических агонистов PPAR (0,1-10 мкМ GW7647), PPAR (0,1-10 мкM L-165041) и PPAR (0,1-мкМ росиглитазона) значимого влияния агонистов на экспрессию COX-1 не обнаружено. Добавление PPAR агонистов (росиглитазона и циглитазона) увеличивало ЛПС-индуцированную экспрессию мРНК COX-2 (Рис. 8), агонисты PPAR и PPAR влияния на экспрессию COX-2 не оказывали.

Для того, чтобы проверить является ли, обнаруженное потенцирование COX-2, вызванное росиглитазоном и циглитазоном специфическим, то есть PPAR-зависимым процессом, мы использовали два независимых подхода:

предобработка астроцитов PPAR антагонистом GW9662 и изучение астроцитов с нокдауном PPAR. Получено, что как ингибирование активности PPAR антагонистом GW9662, так и нокдаун PPAR приводит к снятию эффектов агонистов PPAR (Рис. 8), то есть эффекты росиглитазона и циглитазона являются PPAR-зависимым. Следует отметить, что «базовый» уровень экспрессии COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС, не менялся при обработке астроцитов антагонистом или нокдауне PPAR (Рис. 8), то есть индукция экспрессии COX-2 при обработке астроцитов ЛПС не является PPAR зависимым процессом. Тем не менее, добавление синтетических агонистов PPAR включает механизмы, которые приводят к потенцированию эффекта ЛПС.

Рис. 8. Активация PPAR увеличивает экспрессию COX-2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Астроциты 10 мин пред-обрабатывались антагонистом PPAR или использовались астроциты с нокдауном PPAR. Далее их обрабатывали PPAR агонистами росиглитазоном (Р) и циглитазоном (Ц), затем астроциты стимулировались ЛПС. Через 4 ч стимуляции определялась экспрессия COX-2. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз.

* p<0.05.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»