WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

АЛЁШИН СТЕПАН ЕВГЕНЬЕВИЧ ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ЯДЕРНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ PPAR,, И ЕЁ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА.

Специальность 03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

Работа выполнена на факультете Биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова в группе системной биологии липидов (отдел биокинетики).

Научный консультант: доктор химических наук Сергеева Марина Глебовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович доктор биологических наук Павлова Галина Валериевна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится «_» _ 2009 г. в «» часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.

Белозерского, лабораторный корпус «А», аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Москва.

Автореферат разослан “_” 2009г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Рецепторы пролифераторов пероксисом (PPAR) относятся к классу ядерных рецепторов, регулирующих транскрипцию. Существует три изоформы этих рецепторов –, и. Синтетические агонисты PPAR и PPAR используют для лечения гиперлипидемии и диабета 2 типа, и в настоящее время их предлагают как противовоспалительные средства. Агонисты PPAR как лекарственные средства ещё не зарегистрированы, тем не менее, они считаются перспективными для лечения дислипидемии, ожирения и нарушений механизмов восстановления и регенерации тканей.

Предполагают, что нарушение функций этих рецепторов приводит к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, возникновению рака, гипертонии, развитию нейродегенеративных заболеваний и хронического воспаления. По этой причине транскрипционные факторы PPAR активно изучаются. Эффективность применения синтетических агонистов PPAR для терапии таких дисфункций мозга как инсульт, травма, болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона и др. была показана на животных. Считается что нейропротективные свойства агонистов PPAR связаны с их противовоспалительными эффектами, поэтому в настоящее время актуальны исследования механизмов действия синтетических агонистов PPAR при воспалении, которое моделируется как на уровне целого организма, так и на уровне клеток мозга.

В развитии воспалительных процессов в мозге ключевая роль принадлежит клеткам глии. Среди глиальных клеток следует выделить астроциты, являющиеся основным источником полиненасыщенных жирных кислот и простагландинов - важных провоспалительных веществ и эндогенных лигандов PPAR. Ключевыми ферментами продукции полиненасыщенных жирных кислот и простагландинов являются фосфолипазы А2 и циклооксигеназы, соответственно. Эти ферменты относятся к так называемым PPAR лиганд-синтезирующим ферментам.

Имеются сведения, что применение синтетических агонистов PPAR может приводить к изменениям уровней экспрессии фосфолипаз и циклооксигеназ, однако влияние лигандов PPAR на экспрессию этих ферментов в астроцитах не изучено. В последние годы было охарактеризовано влияние агонистов PPAR и PPAR на различные клеточные ответы астроцитов (пролиферацию, выброс цитокинов, и др.), однако экспрессия самих PPAR при этом не изучалась, хотя известно, что изменение экспрессии PPAR является одним из важных механизмов регуляции этих транскрипционных факторов. Не смотря на то, что ряд данных позволяет предположить наличие взаимодействий между изотипами PPAR на уровне взаимной регуляции их экспрессии, в настоящий момент практически не существует работ, посвящённых исследованию взаимодействий всех трёх изотипов PPAR.

Способность PPAR регулировать экспрессию своих лигандсинтезирующих ферментов с одной стороны, и участие лигандов в регуляции экспрессии самих PPAR с другой стороны, указывают на наличие сложной системы взаимодействий между фосфолипазами А2, циклооксигеназами и PPAR. Тем не менее, до сих пор не было попыток изучить эти белки и взаимосвязи между ними как единую систему функционально взаимодействующих белков. Изучению этой системы и посвящена данная работа.

Цели и задачи исследования Целью данной работы было исследовать взаимосвязь между изоформами PPAR,, и их лиганд-синтезирующих ферментов циклооксигеназы и фосфолипазы А2; установить роль этой взаимосвязи при ответе астроцитов на провоспалительную стимуляцию.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние синтетических агонистов PPAR на экспрессию PPAR, и ; цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 и циклооксигеназ.

2. Установить наличие и характер взаимодействия между изоформами PPAR в астроцитах, стимулированных липополисахаридом (ЛПС), изучить влияние комбинаций синтетических агонистов PPAR на уровни экспрессии PPAR, и.

3. Изучить совместное влияние изоформ PPAR на экспрессию ключевого фермента синтеза простагландинов - циклооксигеназы в астроцитах, стимулированных ЛПС.

4. Установить влияние различных изоформ PPAR на экспрессию цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 в астроцитах, стимулированных ЛПС.

5. Установить PPAR-лигандсинтезирующую роль фосфолипаз А2 и циклооксигеназы в регуляции PPAR-опосредованной транскрипции циклооксигеназы в астроцитах, стимулированных ЛПС.

Научная новизна и практическая значимость работы В работе было впервые показано, что изоформы ядерных рецепторов PPAR, и способны регулировать экспрессию друг друга. В настоящее время многие фармацевтические компании ведут разработки двойных агонистов PPAR, активирующих сразу несколько изоформ PPAR. Данные о взаимодействии изоформ PPAR позволят лучше прогнозировать эффекты этих агонистов.

Впервые было охарактеризовано влияние комбинированного воздействия синтетических PPAR агонистов на уровень экспрессии COX-2. С использованием ингибиторного анализа и метода нокдауна получены данные, подтверждающие ключевую роль PPAR в регуляции экспрессии COX-2; показано, что эндогенные PPAR лиганды, продуцируемые COX-2 и фосфолипазой А2, участвуют в активации ЛПС-индуцированной транскрипции COX-2 за счет связывания с PPAR. Обнаруженные эффекты по влиянию комбинированного применения PPAR агонистов на экспрессию COX-2 позволят разработать методы регулирования экспрессии гена этого фермента при терапии заболеваний с воспалительной компонентой.

Показано участие всех трёх изоформ PPAR в регуляции уровня экспрессии цитозольной и секреторной изоформ фосфолипазы А2 в астроцитах, стимулированных ЛПС. Результаты, демонстрирующие различие в динамике экспрессии фосфолипаз А2 при обработке астроцитов агонистами различных изоформ PPAR, не имеют аналогов в мировой литературе.

В результате проделанной работы была предложена схема системы взаимодействий трёх изоформ PPAR, фосфолипаз А2 и COX-2. В данной схеме учитывается влияние как синтетических, так и эндогенных лигандов, продуцируемых при активации фосфолипаз и циклооксигеназы в процессе воспалительного ответа.

Важность полученных результатов для фундаментальной науки и практической медицины заключена в том, что активация этих ферментов является одним из основных компонентов ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний. Результаты этой работы могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии, патофизиологии и фармакологии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIV, XV и XVI международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2007, 2008, 2009), Международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 5-7 июня 2007 г.; 2-4 июня 2009 г.)", 48ой встрече американского общества клеточных биологов в Сан-Франциско «The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting 2008».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них статей - 2, статей в сборниках -2, материалов конференций - 6.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на _ страницах, содержит рисунков и таблиц, и включает следующие разделы:

«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы» и «Список литературы» (_ цитированных работ).

Список сокращений. PPAR– рецепторы активаторов пролиферации пероксисом; COX– циклооксигеназа; ФЛА2– фосфолипаза А2; ЛПС– липополисахарид клеточной стенки бактерий; ГАФД– глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа; ПНЖК– полиненасыщенные жирные кислоты; ПГ– простагландины.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Астроциты выделяли из мозгов новорожденных крыс, работали на клетках второго пассажа. Воспалительный ответ моделировали липополисахаридом (ЛПС), который является широко используемым провоспалительным стимулом. ЛПС связывается с так называемыми Толлподобными рецепторами, которые встречаются практически на всех клетках животных, в том числе и на астроцитах. Определение экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени с помощью набора «SYBR green PCR Master Mix» (Bio-Rad). Уровень экспрессии генов сравнивали с уровнем экспрессии ГАФД и нормировали на значения, полученные для контрольных клеток. Определение количества белка проводилось методом иммуноблотинга, для проявки использовался ECL-реагент. Данные нормировалась на концентрацию -тубулина, количество белка в контрольных клетках принимали за единицу. ДНК-связывающая активность изоформ PPAR определялась с помощью иммуноферментного набора «PPAR,, Complete Transcription Factor Assay Kit» (Cayman Chemical). Значение активности нормировалось на контрольные клетки, ДНК-связывающая активность изоформ PPAR в которых принималась за 100%. Для трансфекции астроцитов миРНК и плазмидой, сверхэкспрессирующей PPAR, использовалась магнитная трансфекция. Для измерения эффективности нокдауна и сверхэкспрессии использовали иммуноблотинг. Нокдаун считался эффективным при снижении уровня белка на 90%. Концентрация простагландина Е2 в культуральной жидкости измерялась методами ESI/MS и ИФА. Полученные данные обрабатывали по методам корреляционного и вариационного анализа (ANOVA) и критерия Стьюдента (t-тест). Все измерения проводились не менее трех раз. Достоверными считали различия при р<0,05. Все погрешности отражают стандартное квадратичное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. Исследование влияния синтетических агонистов PPAR на экспрессию PPAR, и ; цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 и циклооксигеназ Влияние синтетических агонистов PPAR на экспрессию изоформ PPAR и их лиганд-синтезирующих ферментов ранее не изучалось, поэтому мы исследовали влияние GW7647 (PPAR агонист), L-165041 (PPAR агонист) и росиглитазона (PPAR агонист) на экспрессию этой группы генов. Показано, что синтетический агонист PPAR увеличивает экспрессию PPAR, COX-1 и уменьшает экспрессию цитозольной и секреторной фосфолипаз А2;

синтетический агонист PPAR увеличивает экспрессию PPAR, COX-1, и уменьшает экспрессию PPAR, цитозольной и секреторной фосфолипаз А2;

синтетический агонист PPAR уменьшает экспрессию PPAR, PPAR, COX-2, цитозольной и секреторной фосфолипаз А2. Таким образом, синтетические агонисты всех трех изоформ PPAR оказывают влияние на экспрессию PPAR, и ; цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 и циклооксигеназ.

2. Взаимосвязь PPAR, и в астроцитах, стимулированных ЛПС К началу нашей работы было известно, что уровень экспрессии PPAR и PPAR может меняться под воздействием провоспалительных стимулов.

Тем не менее, на клетках мозга подобных работ не проводилось. Более того, ничего не было известно об изменении уровня экспрессии PPAR под действием провоспалительных стимулов. Поэтому мы исследовали уровни экспрессии трех изоформ PPAR при стимуляции астроцитов ЛПС. Поскольку воспалительный ответ является сложным, динамически развивающимся процессом, на разных этапах которого могут активироваться различные транскрипционные факторы, мы изучали астроциты стимулированные ЛПС в течение 2, 4, 16 и 24 ч.

Получено, что уровни экспрессии PPAR и PPAR при инкубации клеток с ЛПС в течение 2-24 часов снижаются с минимумом при 4 часах стимуляции (Рис. 1А). Эти результаты согласуются с данными полученными на других типах клеток. Нами показано, что уровень мРНК PPAR возрастает при ЛПС стимуляции и к 24 часам значимо отличается от уровня экспрессии PPAR в контрольных клетках (Рис. 1А). Изменения уровней мРНК коррелируют с изменениями количества белка, измеренного иммуноблотингом (Рис. 1Б).

Так как при 4 часах ЛПС стимуляции наблюдаются самые значительные изменения уровней экспрессии, то для дальнейшего изучения нами была выбрана временная точка 4 часа.

Рис. 1. ЛПС снижает экспрессию PPAR, PPAR и увеличивает экспрессию PPAR.

Клетки стимулировались ЛПС в течение 2, 4, 16 и 24 часов. (А) Уровни мРНК изоформ PPAR, измеренные ПЦР в реальном времени; (Б) Количество белка изоформ PPAR определялось с помощью иммуноблотинга. Приведена одна типичная электрофореграмма и результаты денситометрии. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. * p<0.05.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»