WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

100 а б 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14. 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.Рис. 1. Хроматограмма водного экстракта листьев стевии (по методу С.В.Федорова, 2004) a - хроматограмма стандарта стевиозида б - хроматограмма водного экстракта листьев стевии, культивируемой в республике Северная Осетия-Алания Совместно с институтом ВИЛАР в лабораторных условиях по методу, предложенному В.С. Федоровым (2004), из сухих листьев стевии был выделен препарат стевиозида, что было подтверждено методом ТСХ.

Подлинность стевиозида была доказана с помощью С ЯМР. Методом ВЭЖХ было установлено, что содержание стевиозида в выделенной сумме дитерпеновых гликозидов составляло 84 %, и было выше рабочего стандарта, содержащего 75% стевиозида (Вьетнам).

Таким образом, полученные данные показывают, что стевия, культивируемая в республике Северная Осетия – Алания характеризуется высоким содержанием целевых веществ - 11,7%, а получаемый из данного сырья стевиозид 84%-ной степенью чистоты, что обосновывает возможность ее использования в качестве сырья для получения веществ стевиозидного комплекса.

Характеристика целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида как сырья для культивирования дрожжей При изучении химического состава целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида показано, что содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки в шроте и стеблях существенно различается и составляет: «сырой» протеин - 19,7 и 8,2%, «сырая» клетчатка - 20,6 и 46,5 % соответственно. В смешанном субстрате (шрот : стебли – 1 : 2) определено содержание «сырой» клетчатки - 37,8%, что обосновывает возможность использования данного сырья после его гидролиза для получения белково-углеводной кормовой добавки (табл.1).

Таблица Химический состав отходов производства стевиозида (в воздушно-сухом состоянии) Отходы производ- «сырой» «сырой» «сырая» «сырая» БЭВ, ства стевиозида протеин, жир, клетчатка, зола, % % % % % 1. шрот 19,7±0,29 1,9±0,13 20,6±0,22 7,9±0,19 49,9±0,2. стебли 8,2±0,15 1,2±0,10 46,5±0,21 5,2±0,07 35,4±0,3. шрот : стебли – 12,0±0,10 1,5±0,11 37,8±0,09 6,1±0,05 40,2±0,1 : Поскольку в шроте и стеблях растения содержатся остаточные дитерпеновые гликозиды (~ 1%) было исследовано влияние стевиозида на рост дрожжей Y.lipolytica. Исследования показали, что стевиозид в концентрациях 0,5% и 1% не оказывает угнетающего действия на рост дрожжей, что свидетельствует о возможности использования отходов переработки стевии для их культивирования.

Исследование способов предподготовки целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида как сырья для культивирования дрожжей Предподготовка растительного сырья включала стадии измельчения стеблей (0,5-1 мм), суспендирования шрота и измельченных стеблей, термореагентную и ферментативную обработку сырья.

При термореагентной обработке отходов растительного сырья определяли влияние таких параметров, как температура, рН, давление и время воздействия на выход редуцирующих веществ. Результаты исследований показали, что при давлении 0,5 атм., t=110° наибольший выход РВ – 4,5 г/л достигался при кислотном термогидролизе при рН 3.

При исследовании влияния давления и времени экспозиции на выход РВ показано, что при изменении давления в диапазоне от 0,5 до 1,5 атм. при рН=3 выход редуцирующих веществ практически не увеличивался и составлял 4,5-5 г/л, а при повышении давления до 2 атм. выход РВ увеличивался до 7,1 г/л (рис.2.).

При исследовании влияния времени экспозиции при разном давлении показано, что выдержка более 30 мин неэффективна, так как выход РВ при этом практически не повышался (рис. 2.).

7,4, 0,5 атм 1 атм 1,5 атм 1,5 2 атм Время, мин 030 45 Рис. 2. Накопление РВ в процессе термогидролиза отходов производства стевиозида (рН 3, гидромодуль 10) Таким образом, при химическом термогидролизе был достигнут уровень накопления РВ ~ 7,1 г/л. Так как данная концентрация РВ не может обеспечить высокий уровень обогащения белком продукта при культивировании дрожжей, исследовалась возможность ферментативного гидролиза суммарных отходов производства стевиозида Ферментативный гидролиз отходов производства стевиозида Так как эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов в значительной степени зависит от их реакционной способности, было исследовано влияние отношения концентрации субстрата и фермента Целловиридина Г20x, а также условий предподготовки сырья на выход РВ (табл. 2.).

Полученные данные показывают (табл. 2), что наибольшая концентрация редуцирующих веществ в среде определялась при воздействии фермента на измельченное и термообработанное (автоклавирование 0,5 атм. 30 мин.) сырье. Глубина гидролиза изменялась от 88 до 92 % при 10 %-ной концентрации сырья при увеличении концентрации фермента от 0,1 до 1 %.

При увеличении концентрации субстрата в среде с 10% до 15% выход РВ повышался в среднем на 23%, однако показатель глубины гидролиза при этом не менялся.

РВ, г/л Таблица Эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида (время экспозиции - 2 часа) Кон- концентрация субстрата, % цен10 траспособы предподготовки ция измельчение измельчение и ав- измельчение измельчение и авцелтоклавирование токлавирование ловисодер- глубина содер- глубина содер- глубина содер- глубина ридижание гидро- жание гидро- жание гидро- жание гидрона РВ, г/л лиза, РВ, г/л лиза, РВ, г/л лиза, РВ, г/л лиза, Г20х, % % % % % 0,7,2±0,21 79,2±0,44 13,4±0,23 88,8±0,33 9,7±0,26 76,3±0,45 15,3±0,31 86,3±0,0,9,8±0,33 84,7±0,20 15,1±0,19 90,0±0,54 12,3±0,15 81,3±0,20 17,5±0,33 88,0±0,0,10,4±0,27 85,6±0,24 15,5±0,27 90,3±0,43 12,6±0,23 81,7±0,27 18,6±0,16 88,7±0,0,12,3±0,30 87,8±0,30 16,1±0,20 90,6±0,63 15,1±0,15 84,8±0,27 18,7±0,16 88,8±0,1 17,20,12,8±0,34 88,3±0,27 18,3±0,29 91,8±0,28 87,8±0,26 21,8±0,16 90,0±0,Таким образом, на основании проведенных исследований разработаны режимы предподготовки и условия ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида для использования их в качестве сырья для культивирования дрожжей.

Гетерофазное культивирование дрожжей на отходах производства стевиозида. Получение белково-углеводного продукта Отбор продуцентов для гетерофазного глубинного культивирования проводили среди штаммов дрожжей Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Yarrowia lipolytica и Endomycopsis fibuligera С-2, практически применяемых при получении кормового белка на гидролизатах растительного сырья. Эксперименты показали, что все исследованные штаммы способны активно расти на средах, содержащих в качестве источника углерода ферментативные гидролизаты целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида. Для исследований был отобран штамм Y. lipolytica, титр клеток которого в стационарной фазе в 2-3 раза превосходил титр клеток других штаммов.

Для глубинного гетерофазного культивирования дрожжей Y. lipolytica 10%ную водную суспензию, содержащую смешанные шрот и измельченные стебли (0,5-1мм) - 1:2, автоклавировали при 0,5атм. 30 мин. Далее в суспензию вносили фермент Целловиридин Г20х в концентрации 0,2-0,3%. Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,5, t=50°C и перемешивании 200 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях концентрация РВ составила 16 г/л. К полученному ферментативному гидролизату добавляли минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «П» и инокулят дрожжей Y. lipolytica в количестве N0=6,7· 106кл/мл.

Дрожжи Y. lipolytica культивировали в периодическом режиме в ферментере (Vобщ.=5 л.) при t = 28-30°C, рН=4,5-5, при перемешивании – 500-800 об/мин и аэрации. Выращивание дрожжей осуществлялось до начала стационарной фазы.

Показатели гетерофазного глубинного культивирования представлены в таблице3.

Таблица Показатели процесса гетерофазного глубинного культивирования дрожжей Yarrowia lipolytica на ферментативных гидролизатах целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида Концентрация РВ (нач/кон), г/л 16,0/1,Потребление РВ, % 91,Прирост дрожжевых клеток (Nmax-N0), кл/мл х 108 6,0,Удельная скорость роста, max, ч-Концентрация биомассы Х (расчетно), г/л 21,Содержание в сухом продукте:

- «сырого» протеина, % 29,- «сырой» клетчатки, % 20,В процессе гетерофазного культивирования потребление дрожжами редуцирующих веществ составило 91%, прирост дрожжевых клеток - 6,6 кл/мл х 108. Содержание "сырого" протеина в белково-углеводном продукте увеличилось на 17% и составило 29%, а показатель "сырой" клетчатки снизился на 18 % и составил %.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность получения белково-углеводного продукта при гетерофазном глубинном культивирования дрожжей на ферментативных гидролизатах отходов производства стевиозида.

Обогащение микроэлементами белково-углеводной добавки Изучение влияния селена на рост дрожжей Y. lipolytica. Обогащение селеном белково-углеводной добавки Для повышения биологической ценности полученного белково-углеводного продукта изучали возможность его обогащения селеном.

При культивировании Y. lipolytica на средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу, показано, что низкие концентрации селена до 1 мг SeO2/л не оказывали влияния на рост дрожжей. Увеличение содержания в среде культивирования селена выше 4 мг SeO2/л приводило к резкому снижению активности роста дрожжей, а концентрации выше 10 мг/л SeO2 ингибировали их рост. Величина, приводящая к 50% снижению роста культуры, составила 8 мг SeO2/л (рис.

3), что позволяет отнести дрожжи Y. lipolytica к группе нерезистентных к селену дрожжей, которые способны накапливать в биомассе более высокий уровень селена по сравнению с резистентными (Жильцова и др., 1998).

0 5 10 15 20 25 30 Концентрация SeO2, мг/л Рис. 3. Влияние концентраций SeO2 на рост дрожжей, при культивировании на среде с глюкозой Так как, в настоящее время имеется мало данных о механизме действия селена на клетки дрожжей, было исследовано влияние различных концентраций селена в средах культивирования на дыхательную активность селенонерезистентных дрожжей Y. lipolytica. Изучение компонентов дыхательной цепи, участвующих в окисление того или иного субстрата, осуществлялось методом ингибиторного анализа (рис. 4).

Показано, что в норме, в отсутствии селена, при выращивании дрожжей на полноценной среде по сере, окисление осуществлялось в основном через цитохромный путь. В среде, обедненной по сере, наряду с цитохромным путем функционировал и альтернативный, цианидрезистентный путь. Добавление низких Рост, % от контроля концентраций селена, не влияющих на скорость роста дрожжевых клеток, приводило к более полному включению цитохромного пути. Более высокие концентрации селена в среде ингибировали скорость роста клеток и их дыхательную активность. При этом дыхательная активность дрожжей полностью ингибировалось при совместном добавлении KCN и СГ, что свидетельствует о функционировании двух путей окисления – митохондриальной цитохромной системы и альтернативного пути. Создается впечатление, что Se замещает S в клетках, способствуя «нормализации» функционирования митохондрий.

Клетки Клетки Глюкоза Глюкоза KCN 0,5 мМ KCN 1 мМ KCN 0,5 мМ Клетки KCN 1 мМ KCN 0,5 мМ KCN 1 мМ СГ 2 мM Глюкоза СГ 4 мM СГ 4 мM a Клетки СГ 4 мM СГ 2 мM СГ 2 мM Глюкоза СГ 2 мM СГ 4 мM Клетки д KCN 1 мМ СГ 4 мM СГ 4 мM KCN 0,5 мМ Глюкоза СГ 2 мM KCN 1 мМ KCN 1 мМ KCN 1 мМ Клетки б KCN 1 мМ Глюкоза KCN 1 мМ е KCN 1 мM Клетки СГ 4 мM KCN 1 мM Глюкоза СГ 4 мM СГ 4 мM СГ 4 мM СГ 2 мM СГ 4 мM СГ 4 мM СГ 2 мM СГ 2 мM Клетки в СГ 2 мM Глюкоза СГ 2 мM СГ 4 мM KCN 1 мМ ж KCN 1 мМ СГ 4 мM KCN 1 мМ СГ 4 мM KCN 1 мM СГ 4 мM 100 нмоль О KCN 1 мM KCN 1 мM г 1 мин з Рис 4. Кривые поглощения кислорода клетками дрожжей Y. lipolytica (а, б- клетки дрожжей, выращенные на полноценной по содержанию серы среде (контроль 1);

в, г – клетки дрожжей, выращенные на среде, обедненной по сере (контроль 2); д, е – клетки дрожжей, выращенные на среде, обедненной по сере, при добавлении мг/л SeO2; ж, з – клетки дрожжей, выращенные на среде, обедненной по сере, при добавлении 8 мг/л SeO2).

Поскольку ранее было показано, что селенорезистентность дрожжей и накопление селена в биомассе значительно возрастает при культивировании их в условиях, нелимитированных кислородом, а также на среде, обедненной по сере (Жильцова и др., 1996) для изучения накопления селена в биомассе дрожжи куль тивировали в периодическом режиме в ферментере в условиях интенсивной аэрации на среде, обедненной по сере, с глюкозой, при концентрации селена - 20 г/л SeO2, которая не оказывала влияния на продолжительность лаг-фазы и приводила к незначительному снижению активности роста дрожжей – в среднем на 10%.

Содержание серы в среде было снижено с 835,2 мг/л до 6,8 мг/л. При культивировании в таких условиях в начале стационарной фазы роста в биомассе дрожжей накапливалось до 1280 мг/кг SeO2 при содержании «сырого» протеина – 49,8%.

При культивировании дрожжей в ферментере в периодическом режиме в условиях гетерофазного глубинного культивирования на подготовленных отходах производства стевиозида и после осуществления постферментационной обработки был получен белково-углеводный продукт, состоящий из дрожжевой биомассы и твердой неутилизируемой фракции растительных отходов, который содержал 29% «сырого» протеина, 20% «сырой» клетчатки и 187 мг/кг селена.

Исследование возможности йодирования белково-углеводной кормовой добавки на основе целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида В основу разработки метода йодирования белково-углеводного продукта положена известная химическая реакция окисления йодида в присутствии сильного окислителя. Получающийся в результате реакции окисления молекулярный йод взаимодействует с органическими веществами клетки, предположительно, встраиваясь в тирозин, и образовывает прочные ковалентные соединения.

Для изучения возможности введения йода в белково-углеводный продукт, обогащенный селеном, исследовалась возможность обогащения йодом, как растительной биомассы отходов производства стевиозида, так и дрожжей, на разных технологических стадиях получения белково-углеводного продукта.

В таблице 4 представлены данные, характеризующие влияние окислителя в реакционной смеси на процесс «включения» йода в растительную массу. Под понятием «включение» подразумевается количество йода, ковалентно связанного с органическими соединениями клетки, в том числе и с белками. Из данных таблицы 4 следует, что при увеличении концентрации Н2О2 c 2 до 6 мМ/л количество йода в растительной клетке соответственно увеличивается со 100 до 400 мкг /г.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»