WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Цугкиева Елена Борисовна РАЗРАБОТКА ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ СТЕВИИ Специальность: 03.00.23. – Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007 2

Работа выполнена на кафедре биотехнологии инженерно-экологического факультета Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Градова Нина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Борисенко Евгений Георгиевич доктор биологических наук, профессор Складнев Дмитрий Анатольевич

Ведущая организация:

ОАО «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Федерального агентства по управлению Федеральным имуществом»

Защита состоится «»_2007 г. в часов на заседании диссертационного Совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д.9, тел. (499) 978-74-66, факс (499) 978-74-92.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева

Автореферат разослан «»2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ДМ 212.204.13 И.В. Шакир 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В соответствии с современными воззрениями рациональное использование целлюлозосодержащего сырья, применение замкнутых систем материального производства, ослабляя антропогенное воздействие на окружающую среду, повышая эффективность использования солнечной энергии, является одним из необходимых факторов устойчивого развития общества.

Важнейшей проблемой развития современного общества является обеспечение продовольственными белковыми ресурсами, а также необходимыми нутрицевтиками для рационального питания человека (Тутельян, 2002).

Значительный опыт, накопленный в России, показывает эффективность применения методов микробиологического синтеза в решении этой проблемы при использовании целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности (Эрнст, 1988).

К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с последующим глубинным, поверхностным, твердофазным или гетерофазным культивированием микроорганизмов (Шарков и др., 1973; Быков, Прищепов, 1985; Борисенко и др., 2003; Панфилов, 2004).

Гетерофазное глубинное культивирование является одним из наиболее технологичных способов, так как позволяет исключить стадию отделения твердой фракции непрогидролизованного растительного сырья и получать продукт, который содержит не только дрожжевую биомассу, но и непрогидролизованные целлюлозосодержащие продукты, которые при их содержании в кормах в определенной концентрации улучшают биологическую ценность кормов.

Известна способность дрожжей накапливать в биомассе высокие концентрации микронутриентов, что является основой их использования для получения лечебных и профилактических биологически активных добавок, обогащенных селеном, йодом и др. микроэлементами (Жильцова и др., 1998).

Одной из развивающихся отраслей фармацевтической промышленности является получение лечебно-профилактических препаратов из растительного сырья.

Большой интерес представляет растение стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) - источник суммы дитерпеновых гликозидов (стевиозид), обладающих в 250- раз большей подслащивающей способностью, чем сахароза и применяющихся в диетическом питании в качестве заменителя сахара. Уровень накопления дитерпеновых гликозидов зависит от почвенно-климатических условий произрастания стевии (Дзюба, 1998). В настоящее время культивирование стевии осваивается в ряде регионов России, в том числе и в республике Северная Осетия – Алания (РСО-А). В России и ряде зарубежных стран разработаны технологии выделения стевиозида, как для пищевой промышленности, так и для медицинских и фармацевтических целей, однако проблема утилизации отходов производства стевиозида остается нерешенной (Комисаренко, 1994, Федоров, 2004).

Целью настоящей работы явилась разработка основ технологии комплексной переработки стевии, культивируемой в республике Северная Осетия-Алания, с получением целевого продукта - стевиозида и белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной йодом и селеном.

В задачи исследований входило:

- Изучение стевии, культивируемой в предгорной зоне Северного Кавказа, как сырья для получения дитерпеновых гликозидов.

- Разработка основ технологии получения белково-углеводного продукта на основе отходов производства стевиозида:

• исследование режимов предобработки целлюлозосодержащих отходов как субстрата для культивирования дрожжей;

• разработка режимов гетерофазного культивирования дрожжей на отходах производства стевиозида;

- Изучение закономерностей и разработка способов получения белковоуглеводного продукта, обогащенного селеном и йодом;

- Первичная оценка биологической ценности обогащенного йодом и селеном белково-углеводного продукта.

Научная новизна результатов исследований. Впервые изучено содержание дитерпеновых гликозидов в стевии, культивируемой в предгорной зоне Северного Кавказа, и показана возможность ее использования в качестве сырья для получения стевиозида пищевого и медицинского назначения со степенью чистоты целевого продукта 84%. Разработаны режимы предподготовки и ферментативного гидролиза отходов производства стевиозида при использовании ферментного пре парата Целловиридин Г20х, обеспечивающие 90% степень гидролиза. Впервые показана возможность получения белково-углеводного продукта, обогащенного органическими селеном и йодом, при гетерофазном культивировании дрожжей Y.

lipolytica на гидролизатах целлюлозосодержащего сырья. На новом биологическом объекте – дрожжах Y. lipolytica – подтверждены ранее выявленные закономерности обогащения дрожжей селеном. Впервые исследовано влияние селена и серы на общую дыхательную активность клеток дрожжей Y. lipolytica и распределение потока электронов между двумя путями окисления – цитохромным (классическим) и альтернативным, цианидрезистентным. Показано, что при недостатке серы в среде селен замещает серу и способствует «нормализации» функционирования митохондрий. Впервые показана возможность обогащения йодом в органической форме в присутствии окислителя, как растительного компонента, так и обогащенных селеном дрожжей при гетерофазном культивировании Y. lipolytica на ферментативных гидролизатах целлюлозосодержащего сырья.

Практическая значимость. Впервые определен уровень содержания стевиозида (11,7%) в листьях стевии, культивируемой в Предгорной зоне Северного Кавказа, что с учетом урожайности стевии определяет перспективу создания сырьевой базы в республике Северная Осетия – Алания для получения стевиозида. Разработаны основы технологии комплексной переработки стевии с получением препарата стевиозида и белково-углеводной добавки при использовании отходов производства стевиозида. Разработаны режимы гетерофазного глубинного культивирования дрожжей, обеспечивающие получение белково-углеводного продукта с содержанием «сырого» протеина 29%, селена 187 мг/кг и йода до мг/кг. Показано, что обогащение селеном и йодом белково-углеводной добавки повышает биологическую ценность продукта, обеспечивая увеличение прироста живой массы кроликов на 15%.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждены на 2-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006); Международной научнопрактической конференции «Рациональное использование биоресурсов в АПК» (Владикавказ, 2006); Всероссийской научно-технической конференции «Наука – производство – технологии – экология» (Киров, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и трое тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на странице машинописного текста, содержиттаблиц ирисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы и шести глав экспериментальных исследований. Список литературы включает 226 источников, из них 118 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования В работе использовано воздушно-сухое сырье (влажность 8%) – лист стевии сорта «Рамонская сластена», культивируемой в республике Северная ОсетияАлания, а также отходы производства стевиозида, состоящие из шрота, остающегося после водно-спиртовой экстракции дитерпеновых гликозидов из листьев стевии, и стеблей растения. Принимая во внимание соотношение массы стеблей стевии и шрота, образующегося после выделения стевиозида, для исследований использовался смешанный субстрат в соотношении шрот : стебли – 1 : 2.

В работе использовали дрожжи Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Endomycopsis fibuligera С-2, из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.

Менделеева, а также дрожжи Yarrowia lipolytica, любезно предоставленные Звягильской Р. А.

Определение стевиозида осуществляли совместно с ВИЛАР:

- Качественное определение стевиозида - методом ТСХ на пластинах «Silufol UV 254» (Чехия) в системе хлороформ : этанол (2 : 1), проявитель – пары йода.

Спектры 13С ЯМР образцов стевиозида были записаны в дейтерированном пиридине (C5D5N) с концентрацией раствора 0,1 г/мл на спектрометре «Gemini-200» (Varian, США).

Количественное определение стевиозида - методом ВЭЖХ на хроматографической системе Gilson (США). Хроматографические анализы проводили на колонке Luna 5µ C18 (4,6x250 мм, 10 мкм) (Phenomenex, США) с защитной колонкой Security Guard Cartridge C18 (4х3,0 мм) (Phenomenex, США). В качестве подвижной фазы использовали смесь: деионизированная вода (рН 5,5) – ацетонитрил 70 :

30. Объемная скорость 1 мл/мин. В качестве внешнего стандарта использовали сухой очищенный экстракт стевии, предоставленный ЗАО «НПКФ Аквилон».

Ферментативный гидролиз отходов производства стевиозида при использовании Целловиридина Г20х, предоставленного НТЦ «Лекарства и биотехнология», проводили в реакторе периодического действия при перемешивании об/мин при: t - 50°С, рН среды – 5,5, при времени экспозиции – 2 часа.

Дрожжи культивировали в периодическом режиме в колбах Эрленмейера объемом 250 и 750 мл в 100 мл питательной среды. при температуре 28-30°С и перемешивании 120-150 об/мин и в лабораторном ферментере объемом 5 л, снабженном барботером (подача воздуха до 35 л/ч), при перемешивания – 500-об/мин.

При определении селенорезистентности дрожжей и исследовании влияния селена на дыхательную активность в качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 1 %. Дыхательную активность дрожжей регистрировали с помощью прибора Oximetr Lab-Master pQ-8000, в ячейке Островского – Шольца с использованием компьютерной программы для обработки показаний прибора «sholtz2.exe» в институте биохимии им А.Н. Баха РАН. Различное содержание серы в среде культивирования достигали путем замены соответствующих солей серной кислоты на соли соляной кислоты. Для обогащения дрожжей селеном в среду культивирования вносили диоксид селена в различных концентрациях (3-30 мг SeO2/л).

Определение содержания селена в биомассе осуществляли микрофлуористическим методом (Голубкина, 1995).

Биомассу дрожжей отделяли от жидкой фазы центрифугированием при об./мин. в течение 30 минут или методом декантации, далее подвергали термолизу (75°С, 30 мин) и отмывали пятикратно водопроводной водой от неорганического селена и йода при центрифугировании или седиментацией при тех же условиях.

Продукт сушили при комнатной температуре до остаточной влажности 7-8 %.

Исследование внутриклеточного содержания йода осуществляли методом изотопного разбавления совместно с Институтом биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. В качестве источника йода использовали раствор йодида калия в концентрации 1г/л.

Измерение активности образцов 125I осуществляли на жидкостном сцинциляционном счетчике TRI-CARB 21000TR фирмы Packard (США).

Качественное определение продуктов йодирования определяли методом ТСХ на пластинках Fertigplatten Kieselgel 60 (Merck) в камере с системой растворителей 0,1 М раствор йодида калия – этанол (1 : 2). Хроматограммы анализировали на приборе Instant Imager фирмы Packard (США).

При изучении «включения» йода в продукты автолиза концентрацию белка определяли по методу Лоури.

Определение биологической ценности белково-углеводного продукта проводили на базе Горского ГАУ г. Владикавказа методом пар-аналогов на крольчатах калифорнийской породы в возрасте 60 дней. Продолжительность опыта составляла - 60 дней. Рационы балансировались согласно нормам кормления ВИЖ (Калашников и др., 1978).

Статическую обработку результатов проводили на ПК с помощью пакета статистических программ MS Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика стевии, культивируемой в республике Северная Осетия – Алания, как сырья для получения препарата стевиозида В Северной Осетии – Алании разработана технология размножения стевии и ее возделывания по однолетнему циклу при густоте посадки до 60 тыс. экз. раст./ га. Урожайность стевии в этих условиях составляла 9,5 т/га сухого листа и 11 т/га сухих стеблей, что превышало урожайность по сухому листу, достигнутую в Воронежской области (0,8-1,4 т/га) (Удовидченко, Безлер, 1995) и Краснодарском крае (2-3 т/га) (Горбатенко, Дзюба, 1996).

Методом ВЭЖХ определено содержание стевиозида в листьях стевии, культивируемой в республике СО-А на уровне 11,7% (рис.1), в то время, как, по литературным данным, в стевии, культивируемой в Краснодарском крае и Центральной части России, Крыму, Украине, Молдове, Грузии содержание стевиозида не превышало 5-7% (Горбатенко, Дзюба, 1996;. Лисицин, Воловик, 1999).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»