WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Рис.6. Изменение 85 относительного содержания воды в листьях хрустальной 1 сут травки при 1- и 3-дневном 3 сут воздействии солей меди и цинка Контроль Cu-25 Cu-50 Zn-250 Zn-Среди ранних ответных реакций хрустальной травки особое внимание привлекает резкое снижение транспирации, наблюдаемое в течение первых суток роста растений при внесении в корнеобитаемую среду солей ТМ, особенно меди (рис.7).

А Б Zn-100 Cu Zn-Cu 0 0 24 48 72 96 120 144 0 24 48 72 96 120 144 время воздействия, ч время воздействия, ч Рис. 7. Транспирация растений M. crystallinum при действии меди (А) и цинка (Б).

Уже 6-часовое воздействие CuSO4 в концентрации 50 мкМ снижало интенсивность транспирации на 37%, а через сутки – еще на 33%. Значительно более умеренным был ингибирующий эффект цинка. После 6 часов воздействия максимальной концентрации сульфата цинка снижение транспирации составило 18%, но спустя сутки воздействия это значение увеличилось до 47%.

Более низкие концентрации ТМ оказывали меньший ингибирующий эффект. На третьи сутки воздействия ТМ интенсивность транспирации несколько восстановилась, оставаясь, тем не менее не ниже 66% от контроля в случае низких концентраций цинка. Однако более продолжительное пребывание растений в контакте с ТМ усиливало их ингибирующее действие, снижая транспирацию до уровня около 40% от контроля практически при всех ОСВ, % контролю % к контролю транспирация, транспирация, % к испытанных вариантах действия ТМ. Столь раннее и сильное снижение интенсивности транспирации несомненно свидетельствует о том, что ее регуляция инициировалась событиями, произошедшими к этому времени на уровне корня, а не непосредственно в листьях, поскольку существенное поступление цинка и меди в листья удавалось обнаружить не ранее 3 суток роста растений на среде с использованными концентрациями этих ТМ (табл.5).

Таблица 5. Накопление меди и цинка листьями растений хрустальной травки, мкг/г сухой массы 3 дня 7 дней Концентрация солей, мкМ Контроль * 15.CuSO4 25 42 50 88 Контроль * 30.ZnSO4 250 178 500 402 НСР0.05 22 * Культуральная среда содержала 0.25 мкМ CuSO4 и 1 мкМ ZnSO4.

С другой стороны, как показали данные настоящего исследования, значительных изменений водного статуса листьев, которые могли бы инициировать закрывание устьиц, в течение первых суток еще не обнаруживалось. В дальнейшем транспирация растений хрустальной травки, подвергшихся воздействию ТМ, стабилизировалась на заметно более низком уровне, чем у контрольного варианта, что может рассматриваться как один из защитных механизмов на их токсическое действие. С другой стороны, снижение транспирации может иметь у растений хрустальной травки особый эффект в связи с тем, что это – индуцибельное САМ-растение. Являясь эффективной водосберегающей стратегией, САМ-фотосинтез способствует поддержанию водного статуса растений в жестких условиях, тем самым обеспечивая возможность нормального протекания физиологических процессов.

Концентрация протона (рис.8) в листьях контрольных растений на протяжении всего эксперимента лежала в пределах 10 мкэкв/г свежей массы, что характерно для растений хрустальной травки при преимущественном функционировании С3-типа фотосинтеза. Однако, действие меди в самой низкой из использованных концентраций – 25 мкМ уже к третьим суткам эксперимента достоверно повышало содержание протона в тканях листа почти до 30 мкэкв/г свежей массы. Такие значения показателя уже позволяют говорить о начале перехода растений на САМ-тип фиксации углекислоты.

А Б 100,90,80,80,70,60,60,50,40,40,30,20,20,10,0,0, 1 2 3 4 1 2 3 Рис.8. Действие меди (А) и цинка (Б) на интенсивность САМ у растений хрустальной травки на третьи (а) и седьмые (б) сутки эксперимента.

А – 1 – контроль, 2 – NaCl (400 мМ), 3- CuSO4, 25 мкМ, 4 – 50 мкМ Б – 1 – контроль, 2 – NaCl (400 мМ), 3- ZnSO4, 250 мкМ, 4 - 500 мкМ Сернокислая медь в концентрации 50 мкМ за тот же период вызывала увеличение концентрации протона до 37,5 мкэкв/г свежей массы. Аналогичным образом, хотя и менее интенсивно на растения хрустальной травки действовал и сернокислый цинк (рис. 8Б). В то время как величина титруемой кислотности листьев за семь суток у растений, подвергнутых действию меди достигала мкэкв/г свежей массы при использовании 50 мкМ, в варианте с сернокислым цинком в концентрации 500 мкМ она составляла 55,4 мкэкв/г свежей массы, а в концентрации 250 мкМ – 38.4 мкэкв/г свежей массы. Такое резкое усиление интенсивности САМ медью и цинком может быть, по-видимому, индуцировано не только изменением водного статуса растений, но и быть обусловлено возможным участием малата – первичного акцептора углекислого газа при САМ-пути - в связывании ТМ.

Весьма важными представляются впервые полученные данные о влиянии ТМ на дифференциальную экспрессию генов аквапоринов. Интересно, что при этом природа ТМ оказывала большее влияние на изменение содержания мРНК аквапоринов, чем их (солей ТМ) концентрации (рис. 9,10).

Уровень экспрессии генов McРIP1;1, McРIP2;1 и McРIP2;3 в корнях и листьях растений сильно снижался через 1 сутки воздействия меди, и этот мкэкв/г свежей массы мкэкв/г свежей массы пониженный уровень содержания мРНК сохранялся или даже еще более снижался вплоть до полного прекращения экспрессии, как это было обнаружено в отношении гена McРIP2;1 в листьях после 7 суток роста растений хрустальной травки на среде с ТМ (рис.9).

150 McPIP1;100 McPIP1;McPIP2;50 50 McPIP2;0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 1 2 3 4 5 6 время воздействия, ч время воздействия, сут 100 McТIP1;McТIP2;0 3 6 9 12 15 18 21 0 1 2 3 4 5 6 время воздействия, ч время воздействия, сут Рис.9. Уровень мРНК генов аквапоринов McPIP1;4; McPIP1;1; McPIP2;1; McPIP2;3;

McTIP1;2 и McTIP2;2 в листьях растений M. crystallinum в ответ на действие 50 мкМ CuSO4.

При этом, соли цинка не вызывали достоверного снижения через сутки эксперимента количества транскриптов McРIP2;1 в корнях и всех изоформ PIPаквапоринов в листьях (рис.10). Однако, в последующие дни эксперимента различия в воздействии меди и цинка исчезали – через 7 суток происходило существенное снижение количества мРНК всех PIP-изоформ под действием ТМ. Down-регуляция генов аквапоринов в данном случае коррелировала со снижением транспирации, показателей ОСВ и оводненности.

Однако на 3 сутки воздействия происходила up-регуляция генов PIP2аквапоринов в корнях, особенно в случае воздействия меди (рис.11). В литературе по этому поводу существуют данные, которые подтверждают upрегуляцию экспрессии генов аквапоринов в ответ на очень сильное стрессовое воздействие (Galmes et al., 2007; Yamada et al., 1997). Видимо в таких жестких условиях, когда устьичная проводимость низкая, вода поступает слабо, повышение экспрессии аквапоринов способствует увеличению водной проницаемости плазмалеммы, что может помочь стабилизации водного статуса растения.

% от контроля % от контроля % от контроля % от контроля Несколько другой профиль экспрессии наблюдался в отношении аквапоринов тонопласта. Сутки воздействия ТМ не вызывали достоверных изменений экспрессии гена McТIP1;2, но значительно снижали количество транскриптов McТIP2;2 в корнях и листьях растений хрустальной травки.

200 McPIP1;McPIP1;McPIP2;McPIP2;0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 9 12 15 18 21 время воздействия, сут время воздействия, ч 150 McТIP1;McТIP2;0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 1 2 3 4 5 6 время воздействия, ч время воздействия, сут Рис.10. Уровень мРНК генов аквапоринов McPIP1;4; McPIP1;1; McPIP2;1; McPIP2;3;

McTIP1;2 и McTIP2;2 в листьях растений M. crystallinum в ответ на действие 500 мкМ ZnSO4.

Существенно, что в процессе адаптации на фоне пониженного межклеточного водообмена происходило урегулирование внутриклеточного движения воды в корнях, о чем свидетельствует стабилизация количества мРНК McТIP1;2 и McТIP2;2 на уровне контроля через 7 суток воздействия. Если в корнях через 7 суток эксперимента количество мРНК обеих изоформ находилось на контрольном уровне, то в листьях напротив, происходило снижение количества транскриптов McТIP1;2 и McТIP2;2.

Таким образом, первые существенные изменения уровня транскриптов как в корнях, так и в листьях были зафиксированы только через сутки воздействия ТМ. Несмотря на то, что при стресс-реакции (в первые 24ч воздействия) разные гены аквапоринов реагировали неодинаково, адаптация приводила к сглаживанию различий и формированию единой стратегии выживания, которая заключалась в снижении межклеточного воообмена (т.е. водоотдачи) и «консервированию» воды внутри клетки в корнях и листьях растений при стабилизации внутриклеточный водообмена в корнях.

% от контроля % от контроля % от контроля % от контроля McPIP1;McPIP1;McPIP2;McPIP2;0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 9 12 15 18 21 время воздействия, сут время воздействия,ч 150 100 McТIP1;McТIP2;0 3 6 9 12 15 18 21 0 1 2 3 4 5 6 время воздействия, ч время воздействия, сут Рис.11. Уровень мРНК генов аквапоринов McPIP1;4; McPIP1;1; McPIP2;1; McPIP2;3;

McTIP1;2 и McTIP2;2 в корнях растений M. crystallinum в ответ на действие 50 мкМ CuSO4.

На этом фоне обращает на себя особое внимание факт резкого снижения экспрессии гена аквапорина тонопласта McTIP2;2, зарегистрированный в клетках листьев уже через 3 часа действия ZnSO4 и CuSO4 (рис.9,10). Такой большой размер ингибирования – снижение в 4-5 раз в сравнении с контролем – свидетельствует в пользу представления о том, что произошло оно в основной массе клеток листа. Ингибирование экспрессии одного из генов аквапоринов может быть первым шагом на пути торможения водоотдачи листьями при воздействии на растения ТМ, что могло бы в какой-то степени компенсировать вызываемые ими нарушения водообмена. Видимо, торможение водопоглотительной функции корневой системы в условиях подавления транспирации стало причиной ранней реорганизации сложной системы аквапоринов, модификация и адаптация которой особенно важна для условий низкой транспирации, когда апопластное тканевое движение воды сменяется по преимуществу симпластным.

Известно, что количество транскриптов и белков аквапоринов не обязательно коррелирует между собой. Поэтому казалось необходимым оценить воздействуют ли ТМ на уровень белков аквапоринов. Обогащенность микросомальных мембран аквапоринами оценивали на основе интенсивности окраски при иммунологической идентификации изоформ, принадлежащих к PIP1- и PIP2-подсемействам. Согласно полученным данным, количество белка % от контроля % от контроля % от контроля % от контроля PIP-аквапоринов хрустальной травки в корнях после 3 суток воздействия ТМ увеличилось, то есть наблюдалась положительная корреляция между накоплением транскриптов и белка PIP-аквапоринов (рис.12). При этом, 7 суток воздействия ТМ приводили к снижению количества белка PIP-изоформ как в листьях, так и в корнях. Причем в листьях наблюдалось более значительное снижение количества аквапоринов на фоне более низкого, чем в корнях контрольного уровня аквапоринов. Эти результаты также не противоречили данным по содержанию мРНК PIP-аквапоринов, согласно которым ТМ вызывали снижение количества мРНК всех исследованных PIP-изоформ (за исключением McPIP1;4), причем в листьях такое снижение было более драматичным и, в случае McPIP2;1 приводило к полному ингибированию экспрессии гена этого аквапорина.

А Б В 94 К Cu Zn К Cu Zn К Cu Zn 4 Рис.12. Иммунологическая идентификация PIP-аквапоринов в препаратах мембранного белка.А. в корнях растений M. crystallinum при 3-суточном воздействии ТМ. Б, В. в корнях (Б) и листьях (В) растений M. crystallinum при 7-суточном воздействии 50 мкМ CuSO4 (Cu) и 500 мкМ ZnSO4 (Zn).На каждую дорожку нанесено по 7 мкг мембранного белка.

ВЫВОДЫ 1. Проведенные на растениях Mesembryanthemum crystallinum исследования позволили установить дифференциальную экспрессию генов аквапоринов McPIP1;1; McPIP2;1; McPIP2;3; McTIP1;2 и McTIP2;2 в различных органах, в суточной динамике, а также в ответ на действие стрессоров различной природы, интенсивности и продолжительности их воздействия.

2. Исключением являлся ген аквапорина плазмалеммы McPIP1;4, конститутивная экспрессия которого не зависела от органной локализации, времени суток и характера стрессорного воздействия.

3. Зафиксированы корреляции между изменениями основных физиологических параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов в условиях стресса. Водный дефицит, вызванный засолением и действием меди и цинка, сопровождался снижением оводненности листьев, интенсивности транспирации, ОСВ, осмотического потенциала и приводил к down-регуляции генов PIP-аквапоринов в листьях (преимущественно PIP2-изоформ).

4. Стресс-индуцируемое формирование САМ-типа фотосинтеза уже на начальных этапах вызывало снижение трансклеточного переноса воды в суккулентных органах за счет ингибирования экспрессии генов аквапоринов плазмалеммы, но в меньшей степени отражалось на интенсивности внутриклеточного перераспределения воды, о чем свидетельствовало слабое влияние стрессоров на экспрессию генов аквапоринов тонопласта.

5. Изменения в содержании белка PIP-аквапоринов в условиях действия ТМ соответствовали изменениям уровней их транскриптов. Вероятно, регуляция водного статуса при его нарушении, вызванном воздействием солей меди и цинка, происходила на уровне транскрипции генов аквапоринов.

6. Стратегия изменений водного статуса, приводящая к адаптации хрустальной травки к повышенным концентрациям хлорида натрия и солей ТМ, состоит в снижении интенсивности водообмена в листьях и стабилизации внутриклеточного водообмена в корнях. Ключевая роль в реализации этой стратегии принадлежит белкам водных каналов, новообразование которых ингибируется или стабилизируется в условиях стресса на уровне изменения интенсивности экспрессии кодирующих их генов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Trofimova M., Kholodova V., Bozhko K., Meshcheryakov A., Zhestkova I., Kuznetsov V., Abdeeva A., Kuznetsov Vl. Developmental and stress-regulated transition of Mesembryanthemum crystallinum from C3 to CAM photosynthesis:

aquaporin content and cell membrane water permability // Absracts of the ASPB, 2005.

2. Холодова В.П., Абдеева А.Р., Волков К.С., Кузнецов Вас.В., Кузнецов Вл.В. Экспрессия генов аквапоринов при адаптации растений к хлоридному засолению и солям тяжелых металлов // Тезисы докладов, Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». Вологда, 2005. С. 175.

3. Abdeeva A., Kholodova V. The role of aquaporins in Mesembryanthemum crystallinum under salinity // Abstracts of the I (IX) International Conference of Young Botanists in Saint-Petersburg. St.Petersburg, 2006. P.223.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»