WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Трехчасовой стресс достоверно не повлиял на изменение осмотического потенциала (рис.1А). Однако уже после 9 часов воздействия NaCl в листьях растений наблюдалось снижение осмотического потенциала с -0,8 МПа до -1,МПа (при 200 мМ) до -1,6 МПа (при 400 мМ). Сутки засоления вызывали дальнейшее снижение величины осмотического потенциала до -1,5 МПа (в случае 200 мМ) и до -2,1 МПа (в случае 400 мМ). Снижение осмотического потенциала листьев растений хрустальной травки коррелировало с аккумуляцией ионов хлора и накоплением пролина.

В листьях растений контрольного варианта в течение суток эксперимента концентрация ионов хлора составила в среднем 15-19 мкэкв/г свежей массы (рис. 1Б).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 -0,--1,--2,1 2 3 4 5 6 7 8 9 А Б Рис. 1. Осмотический потенциал (А) и накопление ионов хлора (Б) в листьях M.

crystallinum при действии NaCl в течение 3 ч (№2-4), 9 ч (№5-7) и 24 ч (№8-10) 1,2,5,8 – контроль 3,6,9 – 200 мМ NaCl 4,7,10 - 400 мМ NaCl Спустя 3 ч после добавления соли в питательный раствор содержание хлоридионов достоверно не превышало уровень контроля. Однако 9-часовое засоление вызывало значительное по сравнению с контролем накопление ионов хлора, которое превысило контрольные показатели почти в 4 раза (при 200 мМ NaCl) и в 8,5 (при 400 мМ NaCl) раз. Сутки воздействия сопровождались дальнейшей аккумуляцией хлорида в листьях, при этом значения составили 100 и мкэкв/г свежей массы в варианте с 200 мМ и 400 мМ, соответственно, что превысило контрольные значения в 6 и в 12 раз. Накопление таких высоких концентраций осмотически активных соединений и нормальное развитие растения возможно благодаря индукции в присутствии стрессора синтеза совместимых осмолитов, главным образом пролина. Его аккумуляция за сутки солевого шока составила 13,20 мкмоль*г –1св.м.., что почти в 13 раз выше контрольных показателей. Пролин помогает выровнять возникающую разность осмотических потенциалов между компартментами клетки.

Дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в корнях и листьях в суточной динамике. Нами была изучена экспрессия шести генов аквапоринов:

MIP A, MIP B, MIP C, MIP H, MIP F, MIP K. Анализ аминокислотных последовательностей (Kirch et al., 2000) показал, что 4 из них локализованы на плазмалемме (MIP A, B, C, H) и 2 - на тонопласте (MIP F, K). Работ по МПа мкэкв/г свежей массы классификации и созданию филогенетического древа аквапоринов хрустальной травки нет. Но Vera-Estrella et al. (2004) используют новые названия для трех аквапоринов McMIPA, McMIPC, McMIPF в соответствии с номенклатурой, предложенной Johansson et al. (2001). Анализ последовательностей белков, а также порядок их регистрации позволили привести названия шести изучаемых аквапоринов в соответствие с новой номенклатурой (табл. 3).

Таблица 3. Названия аквапоринов хрустальной травки по новой классификации Старое название Новое название комментарии McMIPA McPIP1;4 Vera-Estrella et al., McMIPB McPIP1;1 Абдеева А.Р., неопубл.данные McMIPC McPIP2;1 Vera-Estrella et al., McMIPH McPIP2;3 Абдеева А.Р., неопубл.данные McMIPF McTIP1;2 Vera-Estrella et al., McMIPK McTIP2;2 Абдеева А.Р., неопубл.данные Сравнение интенсивности экспрессии изученных генов в разных органах контрольных растений хрустальной травки показало (рис.2А), что значительные различия обнаружены по экспрессии гена McPIP2;1, существенно более высокая активность которого была характерна для корней.

McPIP1;McPIP1;McPIP2;McPIP2;McTIP1;McTIP2;1 2 3 В 1 2 А Б Рис.2. А.Уровень мРНК генов аквапоринов McPIP1;4 (PIP A); McPIP1;1 (PIP B);

McPIP2;1 (PIP C); McPIP2;3 (PIP H); McTIP1;2 (TIP F) и McTIP2;2 (TIP K) в листьях (1) и корнях (2) растений M.crystallinum. Б,В. Уровень мРНК генов аквапоринов в корнях (Б) и листьях (В) растений M.crystallinum. 1, 2, 3 – контрольные варианты, 12.00 ч (1), 15.00 ч (2), 21.00 ч (3).

Аквапорин McPIP2;1 был назван корнеспецифичным (Fukuhara et al., 1999).

Среди других изученных генов для McPIP1;1 и McTIP1;2 было отмечено некоторое, хотя и небольшое превышение содержания мРНК в листьях в сравнении с корнями.

Было обнаружено, что экспрессия генов аквапоринов McPIP1;1; McPIP2;1;

McPIP2;3; McTIP1;2 и McTIP2;2 изменялась в течение суток в листьях, в то время как в корнях подобная динамика была характерна для McTIP1;2 (рис.2).

К 15.00 ч дня интенсивность экспрессии гена аквапорина McTIP1;2 снижалась почти в 2 раза и оставалась на таком уровне до вечера. Некоторое снижение уровня мРНК к 21.00 ч наблюдалось и для McPIP2;3. Напротив, в листьях обнаруженные суточные изменения содержания транскриптов были направлены в сторону повышения (рис.2В). Так, количество мРНК McРIP1;значительно увеличивалось к 15.00 ч по сравнению с 12.00 ч, возрастая и к 21.00 ч, затем оставалось на высоком уровне спустя сутки. Подобная закономерность была обнаружена для аквапоринов McPIP2;1; McPIP2;3;

McTIP1;2 и McTIP2;2, содержание мРНК которых возрастало в 15.00 и оставалось выше дневного (12.00 ч) уровня. Только для аквапорина McPIP2;3 к вечеру наблюдалось снижение количества транскриптов.

Было установлено, что интенсивность и продолжительность засоления определяла дифференциальную экспрессию генов аквапоринов. При умеренном засолении уровень мРНК PIP1-аквапоринов в корнях и в листьях незначительно отличался от контрольного на протяжении всех экспериментов. Однако количество мРНК PIP2-изоформ в листьях к 3 часам засоления падало на 70% и ниже от уровня контроля и сохранялось на низком уровне в последующие суток стресса. В то же время количество мРНК аквапоринов тонопласта снижалось в первые часы воздействия в корнях и спустя сутки засоления восстанавливалось до уровня контроля у TIP2-изоформы и выше контроля – у TIP1-изоформы. При этом в листьях интенсивность экспрессии генов TIPаквапоринов несущественно отличалась от контроля на протяжении всего опыта.

В случае солевого шока (400 мМ NaCl) дифференциальная экспрессия генов аквапоринов выражалась в том, что уровень мРНК McPIP1;1 в корнях и листьях падал через 9 часов воздействия, но восстанавливался в корнях к 3-м суткам засоления до контрольного, а в листьях продолжал снижаться (рис.3).

Напротив, содержание транскриптов PIP2- и обеих TIP-изоформ в корнях не только не снижалось при солевом стрессе, но и в 2 раза превышало контроль на 3 сутки воздействия у PIP2- и на 1 сутки у TIP-аквапоринов (рис.4), стабилизируясь в последующие дни на контрольном уровне. При этом в листьях происходило резкое снижение уровня транскриптов мРНК PIP2изоформ, которое не превышало 30% от контроля в последующие дни эксперимента. Солевой шок вызывал постепенное понижение в содержании мРНК TIP-изоформ, незначительное – в случае McTIP1;2.

100 McPIP1;McPIP1;McPIP2;50 McPIP2;0 3 6 9 12 15 18 21 0 1 2 3 4 5 6 время воздействия, ч время воздействия, сут McТIP1;McТIP2;0 3 6 9 12 15 18 21 0 1 2 3 4 5 6 время воздействия, ч время воздействия, сут Рис. 3. Уровень мРНК генов аквапоринов McPIP1;4; McPIP1;1; McPIP2;1; McPIP2;3;

McTIP1;2 и McTIP2;2 в листьях растений M. crystallinum в ответ на солевой шок.

Интересно, что характерный профиль экспрессии аквапоринов в листьях не обнаруживался в корнях, что отмечается в литературе (Yamada et al., 1997; Jang et al., 2004). Эти результаты подразумевают, что вклад отдельной изоформы аквапорина при водном стрессе различается в корнях и в листьях, а регуляция дифференциальной экспрессии аквапоринов включает интеграцию различных сигналов.

150 McPIP1;100 McPIP1;4 McТIP1;McPIP2;1 McТIP2;50 McPIP2;3 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 3 6 9 12 15 18 21 время воздействия, ч время воздействия, ч Рис. 4. Уровень мРНК генов аквапоринов McPIP1;4; McPIP1;1; McPIP2;1; McPIP2;3;

McTIP1;2 и McTIP2;2 в корнях растений M. crystallinum в ответ на солевой шок.

% от контроля % от контроля % от контроля % от контроля % от контроля % от контроля Проведенные исследования показали наличие корреляции между изменениями основных параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов при солевом стрессе. Первые 3 ч солевого стресса характеризовались достоверным снижением транспирации и содержания воды в листьях. Это сопровождалось down-регуляцией в первую очередь генов PIPаквапоринов, что вызывало снижение межклеточного транспорта воды и, следовательно, устьичной проводимости для поддержания водного статуса растений. На организменном уровне это характеризовалось потерей тургесцентности листьев. Следующие 6 ч воздействия хлорида натрия приводили к достоверному снижению ОСВ и осмотического потенциала на фоне низкой оводненности и низкой транспирации. Именно на этом этапе начинали проявляться концентрационные различия воздействия соли. Так, достоверное снижение уровня экспрессии генов McPIP1;1; McТIP1;2 и McТIP2;2 было показано только при воздействии 400 мМ NaCl. Downрегуляция генов аквапоринов, так же как и в первые часы воздействия, наблюдалась у PIP-изоформ в листьях (преимущественно у PIP2). Таким образом, острый водный дефицит приводил к сокращению межклеточного водообмена в листьях, но не в корнях. Уменьшение водной проводимости плазмалеммы способствовало сохранению воды в клетке в начальный период стресса. Интересно, что солевой шок приводил к постепенному сокращению внутриклеточного водообмена в течение 7 суток в листьях за счет снижения экспрессии TIP-изоформ, что, видимо, способствовало снижению водоотдачи в тканях листа. Напротив, содержание транскриптов PIP2- и обеих TIP-изоформ в корнях не только не снижалось при солевом стрессе, но, напротив, в 2 раза превышало контроль на 1 сутки у TIP- и на 3 сутки воздействия у PIP2аквапоринов, стабилизируясь в последующие дни на контрольном уровне.

Подобное повышение активности аквапоринов связано, по-видимому, с восстановлением массового поступления воды в растения, что отражалось и на показателях оводненности листьев и ОСВ.

Экспрессия генов аквапоринов в растениях хрустальной травки при индукции водосберегающего механизма фотосинтеза САМ-типа в условиях солевого шока. Растения 6-недельного возраста, на которых были проведены основные эксперименты, осуществляли С3-тип фотосинтеза, о чем однозначно свидетельствуют данные, представленные на рис. 5, в соответствии с которыми во всех контрольных вариантах, независимо от времени фиксации листьев, отсутствовала мРНК ключевого фермента САМ-типа фотосинтеза - ФЕПК (Рис.5, 1,2,4,6). Однако в ответ на 3-х часовое засоление растения реагировали индукцией экспрессии гена, кодирующего данный фермент (Рис.5, 3), интенсивность которой усиливалась к 9 и, тем более, к 24 часам воздействия NaCl. Подобный подход дал возможность оценить стресс-зависимое изменение интенсивности экспрессии генов аквапоринов в процессе перехода растений на САМ-тип фотосинтеза.

1 2 3 4 5 6 Рис. 5. Влияние 400 мМ NaCl на уровень мРНК гена фософоенолпируваткарбоксилазы в листьях растений M.crystallinum. 1, 2, 4, 6 – контрольные варианты: начало эксперимента - (1), 3 часа (2), 9 часов (4) и 24 часа (6). 3, 5, 7 – продолжительность воздействия NaCl мM: 3 часа (3), 9 часов (5) и 24 часа (7).

Существенно, что на самом раннем этапе ответа растений на солевой стресс, когда водосберегающий механизм фотосинтеза САМ-типа еще не сформирован, растения реагируют ингибированием интенсивности экспрессии генов аквапоринов, что направлено на понижение водопроницаемости клеточных мембран и, прежде всего, плазмалеммы, и более экономное расходование воды в условиях жесткого водного дефицита. Характерно, что стресс-индуцируемое формирование САМ в меньшей степени отражается на интенсивности внутриклеточного перераспределения воды, о чем свидетельствует слабое влияние засоления на экспрессию генов аквапоринов тонопласта. Полученные в настоящей работе результаты, а также доступные литературные данные позволяют высказать предположение, согласно которому стратегия изменений водного статуса, приводящая к адаптации хрустальной травки к засолению, состоит в снижении интенсивности внутри- и межклеточного водообмена. Ключевая роль в реализации этой стратегии принадлежит, очевидно, белкам водных каналов, новообразование которых ингибируется в условиях солевого шока на уровне снижения интенсивности экспрессии кодирующих их генов.

Адаптация растений хрустальной травки к действию токсических концентраций меди и цинка. В литературе довольно часто отмечается факт нарушения водного статуса при действии ТМ на растения, однако чаще всего исследуются ответы на их долговременное воздействие. Между тем, нарушение водного статуса растений, по-видимому, следует рассматривать как одно из ранних проявлений токсического действия ТМ. На растениях хрустальной травки такой характерный признак неблагоприятных сдвигов как заметное подвядание листьев проявлялся на вторые-третьи сутки воздействия даже при умеренных концентрациях сернокислых солей меди и цинка.

Оказалось, что рост растений на среде с ТМ приводил к сильному снижению содержания воды в листьях (табл.4).

Таблица 4. Содержание воды в листьях растений хрустальной травки Вариант 1 день 3 дня 7 дней 1 день 3 дня 7 дней % от свежей массы г H2O/г сухой массы Контроль 96.93 96.75 96.78 31.57 29.77 30.CuSO4 25 мкМ 96.83 95.63 93.42 30.55 21.88 14.CuSO4 50 мкМ 95.73 94.88 91.15 22.42 18.53 10.ZnSO4 250 мкМ 96.84 96.27 94.81 30.65 25.81 18.ZnSO4 500 мкМ 96.71 95.85 93.85 30.44 23.10 15.НСР0,05 0.21 0.33 0.29 0.9 1.2 1.Падение оводненности особенно резко происходило при действии меди. В вариантах с умеренной концентрацией меди (25 мкМ) оводненность тканей листа уже к третьим суткам воздействия снизилась почти в 1,5 раза. Еще более резкое падение оводненности отмечалось в вариантах с 50 мкМ сульфата меди.

К 7 суткам эксперимента содержание воды в листьях растений этого варианта снижалось в 3 раза. Менее негативно на содержании воды в листьях растений хрустальной травки сказывалось присутствие в среде цинка.

На существенные структурные изменения, возникающие в клетках листьев при росте растений хрустальной травки на среде с ТМ, указывает достоверное снижение относительного содержания воды, наступающее уже на 1 сутки воздействия (рис.6). Так, за 24 часа действия 25 мкМ CuSO4 ОСВ снизилось на 7% от контроля, а 50 мкМ CuSO4 - почти на 15%. Через 3 суток максимальное снижение насыщенности, вызванное высокими концентрациями CuSO4 (мкМ), достигло 25%, ZnSO4 (500 мкМ) - 15%.

Значительное снижение осмотического потенциала клеточного сока (в раза), происходящее в условиях сильного снижения оводненности листьев, могло способствовать нормализации водного статуса растений. Очевидно, что синтез и аккумуляция пролина, концентрация которого к 7 суткам эксперимента составляла 8,1 мкмоль*г –1св м. (при воздействии 50 мкМ CuSO4) по сравнению с 0,82 мкмоль*г –1св м. в контроле, способствовала снижению осмотического потенциала.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»