WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

АБДЕЕВА Анна Рамильевна ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ АКВАПОРИНОВ В РАСТЕНИЯХ Mesembryanthemum crystallinum L. В УСЛОВИЯХ СОЛЕВОГО СТРЕССА И ПРИ ДЕЙСТВИИ МЕДИ И ЦИНКА 03.00.12 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Научный консультант:

кандидат биологических наук Холодова Валентина Павловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Балнокин Юрий Владимирович кандидат биологических наук, доцент Косулина Людмила Георгиевна

Ведущая организация: Российский Государственный Аграрный Университет – Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева

Защита состоится 20 мая 2008 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул.

Ботаническая, 35.

Факс: (095) 977 8018, e-mail: ifr@ippras.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «17» апреля 2008 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук М.И. Азаркович 2

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Растения постоянно поглощают и выделяют воду. На уровне клеток и органелл движение воды обычно занимает секунды.

Но на тканевом или органном уровне ситуация может быть другой. Перенос воды на дальние расстояния по проводящим тканям в основном не встречает препятствий между клетками. Но транспорт воды на короткие расстояния, который включает апопласт, симпласт и трансклеточный путь, в последних двух случаях определяется транспортом через мембраны клеток. В условиях, когда возможен только «cell-to-cell» транспорт (симпласт, трансклеточный путь), регуляция активности водных каналов оказывает наибольшее влияние на гидравлические свойства ткани. Присутствие аквапоринов в клеточных мембранах дает организму возможность регулировать водный поток внутри и между клетками. Механизмы регуляции аквапоринов в процессе онтогенеза, а также в ответ на действие факторов внешней среды включают транскрипционный, трансляционный и посттрансляционный уровни. Основное внимание в исследованиях уделяется трансляционному и посттрансляционому механизмам. Тем не менее, дифференциальная экспрессия генов аквапоринов также является важным механизмом регуляции в условиях водного дефицита, однако изучена недостаточно.

Факультативный галофит хрустальная травка (Mesembryanthemum crystallinum L.) уже длительное время используется в качестве модели для изучения механизмов адаптации к экстремальным условиям. Как оказалось, соли тяжелых металлов (ТМ), так же как и засоление вызывают нарушения водного статуса растений хрустальной травки. Следует отметить, что лишь очень небольшое число работ посвящено изучению воздействия тяжелых металлов на аквапорины животных (Zelenina et al., 2003; 2004; Tritto et al., 2007), а исследования по воздействию солей меди и цинка на экспрессию генов аквапоринов растений ранее не проводились.

Таким образом, остается открытым вопрос, в какой мере дифференциальная экспрессия генов аквапоринов определяет стабилизацию водного статуса растений хрустальной травки в условиях действия хлорида натрия и солей тяжелых металлов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выявление дифференциальной экспрессии генов аквапоринов в растениях хрустальной травки и изучение роли этого процесса при адаптации растений к хлоридному засолению и к избыточным концентрациям солей меди и цинка. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать воздействие хлорида натрия, повышенных концентраций меди и цинка на основные физиологические параметры, характеризующие водный статус растений, а также выяснить, сопровождаются ли такие изменения стресс-индуцированным формированием важного водосберегающего механизма – фотосинтеза САМ-типа.

2. Выяснить, в какой мере реализуется дифференциальная экспрессия генов аквапоринов в рамках суточных, онтогенетических и органных изменений водного статуса, вызываемых воздействием повышенных концентраций хлорида натрия и солей меди и цинка.

3. Сопоставить изменения основных физиологических параметров водного статуса растений с изменениями экспрессии генов аквапоринов при действии изучаемых стрессоров.

4. Исследовать воздействие повышенных концентраций меди и цинка на изменение экспрессии индивидуальных изоформ аквапоринов на транскрипционном и трансляционном уровнях.

5. Оценить возможную роль аквапоринов в адаптации растений к повышенным концентрациям хлорида натрия и солей меди и цинка.

Научная новизна. Впервые исследована дифференциальная экспрессия шести генов аквапоринов растений M. crystallinum в различных органах, в суточной динамике, а также в ответ на действие факторов внешней среды различной природы, силы и продолжительности воздействия. Обнаружено существование корреляций между изменениями основных параметров водного статуса растений и экспрессией генов аквапоринов при воздействии повышенных концентраций хлорида натрия и солей тяжелых металлов.

Проведена оценка обогащенности мембран, изолированных из тканей растений хрустальной травки, подвергнутых воздействию тяжелых металлов, изоформами аквапоринов PIP-группы. Впервые была исследована корреляция между накоплением транскриптов и белка PIP-аквапоринов при воздействии повышенных концентраций солей тяжелых металлов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные об особенностях действия хлорида натрия, солей цинка и меди на изменение параметров водного статуса растений, а также о механизмах устойчивости к данным стрессорам имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов.

Полученные результаты создают основу для дальнейшего углубления исследований молекулярных механизмов регуляции трансклеточного потока воды и адаптивных свойств растительных клеток. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных может использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на I (IX) международной конференции молодых ботаников С.-Петербурге (С.Петербург, 2006), на годичном собрании Общества физиологов растений России и конференции «Физиология растений – фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006), на международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц, 20 рисунков;

библиография содержит 184 название, в т.ч. 176 на иностранных языках.

Объект и методы исследования Объектом исследований служила хрустальная травка (Mesembryanthemum crystallinum L.), для ее выращивания в водной культуре использовали модифицированную питательную среду Johnson (Winter, 1973) с железом в нитратной форме. Растения выращивали в камере фитотрона при дневной температуре 23-25оС и ночной 18-20оС. Для проведения опытов использовали растения M. crystallinum в возрасте 4-10 недель. Началом опыта являлся момент внесения CuSO4, ZnSO4 и NaCl. Использовали концентрации CuSO4 – 25 и мкМ, ZnSO4 - 250 и 500 мкМ; NaCl – 200 и 400 мМ. Продолжительность каждого эксперимента составляла 3, 9, 24, 72, 168 ч. В каждой точке эксперимента фиксировали листья 3-4 ярусов снизу (не считая семядольных) и корни.

Общее содержание воды определяли высушиванием листьев при 70оС до стационарного состояния. Определение интенсивности транспирации листьев проводили общепринятым гравитационным методом по Иванову (Пустовой и др., 1995). Для определения осмотического потенциала отжимали клеточный сок после замораживания-оттаивания растительных тканей. Измерения проводили на осмометре Osmomat 030 фирмы «Gonotac». Содержание свободного пролина определяли с помощью кислого нингидринового реактива по методу Bates et al. (1973). Определение содержания меди и цинка в тканях растений проводили на атомно-абсорбционном спектрофотометре.

Определение содержания ионов хлора проводили с помощью ионселективных электродов на ионаналайзере «Orion EA 940» фирмы «Orion» (США). Об индукции и развитии САМ судили по изменению характерной суточной динамики титруемой кислотности клеточного сока.

Выделение тотальной РНК из корней и листьев хрустальной травки проводили с использованием RNeasy Mini Kit фирмы QIAGEN. Реакцию обратной транскрипции проводили, как указано в руководстве фирмы Fermentas. ПЦР-анализ и электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле (11,3% в зависимости от размера продукта) проводили в присутствии бромистого этидия. Для проведения полимеразной цепной реакции были подобраны праймеры, приведенные в таблице 1. Для количественной оценки полученных результатов использовали программу 1D-Scan.

Таблица 1. Праймеры для проведения ОТ-ПЦР транскрипт 5' - праймер 3' - праймер McPIP1;GTCATGGTCGTTCTACAGAG GAGAAGACGGTGTAGACAAG McPIP1;ACTGCTGGTATCTCAGGTGG GATGATAGCAGCACCGAGAC McPIP2;CCAACACGAACGCTGACCAA GTGAACCATGAACACCGCGA McPIP2;CTGCACTGCCGGTATCTCTG TTGCTGTAGCCGACGCTTAG McTIP1;TGGCAGAGTTCATCTCCACC TCCGATGAGTGGGCCGACCC McTIP2;GGCCAGATCACCATCCTCAC AAGTCACCACTGGCGAGAGC ACT 3M GTGATCTCCTTGCTCATACG GGnACTGGAATGGTnAAGG PEPc TGGATCCCATTACTACGCACC TCCAAGAGAGCTCGCCATTCT Для получения микросомальных мембран соответствующие органы растений гомогенизировали в среде, содержавшей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Трис-НСl (pH 8.0), 10 мM ЭДТА, 5 мМ метабисульфит калия, 5 мМ дитиоэритритол, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и 0,6%-ный (в/о) поливинилпирролидон. Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 10000g 10 мин. Из супернатанта осаждали микросомальные мембраны центрифугированием при 100000g 30 мин. Содержание белка определяли по методу Bradford (1976). Электрофоретическое разделение белков проводили в 12.5% ППА геле по методу Laemmli (1970) в камере Mini-Protean 3 Cell (“BioRad”, США). На дорожку геля наносили 7-15 мкг белка. Перед электрофорезом препараты мембранных белков смешивали в равных объемах с 2Х буфером для образца, содержащим 125 мМ Трис-НСl (pH 6.8), 4% (в/о) SDS, 20% (в/в) глицерин, 200 мМ ДТТ, 0.02% (в/о) бромфеноловый синий. Для выравнивания содержания белка во все препараты добавляли 1Х буфер и проводили денатурацию белка при 960С (5 мин). После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Nitrocellulose membrane, 0.micron (“Sigma-Aldrich”), используя Trans-Blot SD (“BioRad”) по Towbin (1979).

После переноса белков нитроцеллюлозную мембрану отмывали в среде PBST и блокировали 1 ч в той же среде с добавлением 3%-го (в/о) сухого обезжиренного молока при комнатной температуре. Затем мембрану инкубировали в течение ночи при 40С с первичными антителами в разведении 1:50. Антитела были получены против синтетической консервативной 20аминокислотной последовательности аквапоринов PIP-семейства, конъюгированной с БСА. Сыворотка была любезно предоставлена д.б.н. М.С.

Трофимовой (лаб.мембран ИФР РАН). После инкубации с первичными антителами мембрану отмывали в PBST и инкубировали со вторичными козьими антикроличьими антителами (1:1000), конъюгированными с щелочной фосфатазой, в течение 1,5 ч. После инкубации со вторичными антителами мембрану отмывали сначала в PBST, затем в растворе ДЭА, содержавшем 0.М диэтаноламин (рН 9.6) и 1 мМ MgCl2. Аквапорины визуализировали, используя цветную реакцию на щелочную фосфатазу в растворе, содержащем 1.5 мг BCiP, 3 мг NBT, 30 мл ДЭА.

Результаты и обсуждение Адаптация растений хрустальной травки к засолению. Известно, что при засолении резко снижается доступность воды для растений. Хрустальная травка характеризуется высокой оводненностью тканей. Закрытие устьиц является одним из главнейших механизмов, позволяющих сохранять в жестких условиях засоления нормальное тургорное давление. При внесении соли в питательный раствор наблюдалось заметное подвядание растений хрустальной травки в течение первых 6 часов опыта, вместе с тем было отмечено значительное (в 3 – 6 раз в сравнении с контролем) снижение интенсивности транспирации уже через 3 часа после начала засоления. Такие быстрые темпы снижения транспирации позволили опытным растениям уже в первые сутки практически полностью восстановить нормальное тургорное давление. Оказалось, что солевой стресс сопровождался снижением основных показателей, характеризующих водный статус растений: оводненности, относительного содержания воды и осмотического потенциала листьев. Падение оводненности наблюдалось уже при 3-часовом воздействии хлорида натрия (табл.2).

Таблица 2. Содержание воды в листьях растений хрустальной травки 3 ч 9 ч 24ч 72 ч 3 ч 9 ч 24ч 72 ч Вариант г H2O/г сухой массы ОСВ, % Контроль 30,3 18,6 28,4 32,3 73,8 79,1 76,4 81,NaCl 200 мМ 18,2 17,5 21,2 24,6 67,9 69,3 66,5 79,1.NaCl 400 мМ 17,9 18,2 24,6 60,4 66,7 64,8 72,НСР0,05 0.9 1.2 1.1 0.1.1 0.6 0.5 0.Содержание воды в тканях листа опускалось до 17,5-18,5 г H2O/г сухой массы при контрольном значении 30,3 г H2O/г сухой массы. Через 1-3 суток опыта наблюдалось постепенное восстановление показателей оводненности, которые превысили значения 24 г H2O/г сухой массы. В первые часы воздействия наблюдалось достоверное снижение относительного содержания воды (ОСВ) на 6% в случае умеренного засоления (200 мМ) и на 14% при солевом шоке более жестком воздействии (400 мМ). Такой уровень ОСВ сохранялся при 9- и 24-часовом стрессе. Через 3 суток солевого стресса наблюдалось восстановление показателей ОСВ при умеренном засолении.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»