WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

А - конкурентный анализ с антителами к р65, р50 субъединицам и -актинину-4. Б – анализ при сочетании методов торможения ДНК-белковых комплексов в геле и вестернблотинга. Цветовая маркировка: красный - Вспецифичные ДНК–белковые комплексы, зеленый – окраска антителами к р65, синий – окраска антителами к р50, черный – окраска антителами к -актинину-4. В - схематическое представление областей перекрывания. 1 экстракты клеток без воздействия, 2 экстракты клеток после воздействия ЭФР.

Область перекрывания р65, -актинина-4 и ДНК заштрихована и указана стрелкой. Цифры слева – ДНК-белковые комплексы I, II, III.

Для уточнения результатов конкурентного анализа мы провели исследование методом shift-western, который подтвердил, что в экстрактах активированных клеток комплекс II содержит р65. В этом случае р65 выявлялся в виде широкой полосы, в которой можно выделить две области, которые мы обозначили как а и б (рис.9, Б). Полоса а соответствует подвижности р65 в экстракте неактивированных клеток, когда не образуется специфический ДНК-белковый комплекс. Полоса б выявляется в экстракте активированных клеток на уровне комплекса II. Анализ с антителами к -актинину-4 показал, что он обнаруживается как в активированных, так и в неактивированных экстрактах. Зона перекрывания положения актинина-4 с положением р65 и комплексом II представлена на рис.9, В как заштрихованная область, указанная стрелкой. Присутствие р50 субъединицы NF-B в составе комплекса II подтвердилось также и shift-western анализом. Данные, полученные методом shift-western, позволяют предположить, что -актинин-4 может входить в состав B-специфического ДНК-белкового комплекса.

Однако оказалось, что подвижность -актинина-4 в нативном геле в составе чистых белковых экстрактов практически совпадает с подвижностью -актинина, после взаимодействия экстрактов с ДНК. Следовательно, однозначно ответить на вопрос о присутствии -актинина-4 в составе комплекса, взаимодействующего с Bпоследовательностью ДНК, с помощью этого метода не удалось. Эту сложность мы пытались обойти, анализируя взаимодействие очищенных N- и С-концевых фрагментов р65 с консенсусной последовательностью ДНК в присутствии очищенного белка актинина.

В химерном белке GST-p65 содержится сайт узнавания протеазы тромбина.

Переваривание тромбином позволяет получить N- и С- концевой р65 в растворе в свободном виде. Выход р65 в супернатант после переваривания тромбином контролировали с помощью вестерн-блот-анализа. Анализ методом торможения в геле показал, что только N-концевой домен р65 способен образовывать В-специфичный ДНКбелковый комплекс, причем, в ПААГ он движется быстрее, чем комплекс II ядерных экстрактов (рис.10).

Поскольку взаимодействие р65 с ДНК осуществляется за счет N-концевой последовательности, содержащей ДНК-связывающий домен, важно было понять, сохраняется ли комплекс р65 субъединицы с B-специфичной последовательностью ДНК в присутствии -актинина. Добавление -актинина в реакцию связывания приводило к сдвигу максимума распределения плотности, соответствующей ДНК-белковому комплексу, в сторону более низкой электрофоретической подвижности по сравнению с положением максимума комплекса, образованного N-концевым р65 с Впоследовательностью без добавления -актинина (рис.10). Следовательно, взаимодействие с -актинином-4 не препятствует образованию кВ-специфического ДНК-белкового комплекса, а только изменяет его подвижность.

Рис.10. Взаимодействие Nконцевого домена р65 с Впоследовательностью в присутствии актинина.

Анализ методом торможения ДНКбелковых комплексов в геле.

Электрофореграмма и графическое представление данных, полученных с помощью программы Scion Imagе 1- ядерный экстракт (на графике зеленый). 2- N- концевой домен р65 (на графике - красный). 3- добавление -актинина в реакцию связывания N- концевого домена р65 с В-последовательностью (на графике - синий). 4 плазмида pGex, не содержащая последовательность р65. 5 - С- концевой домен р65.

Заключение Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии и биохимического анализа субклеточных фракций демонстрируют существование в цитоплазме как связанного с актиновыми структурами пула р65, так и несвязанного (диффузного). На всех этапах реорганизации актинового цитоскелета, вызванных как адгезией к фибронектину, так и воздействием ЭФР, р65 в цитоплазме обнаруживался в связи с F-актином, в области стресс-фибрилл и раффлов. Помимо этого, р65 выявлялся в дискретных актинсодержащих областях, названных пэтчами, в которых присутствовали также белки, характерные для комплексов, связанных с фокальной адгезией. Накопление р65 под влиянием ЭФР в областях, связанных с фокальной адгезией, свидетельствует в пользу того, что присутствие р65 в этих областях является одним из этапов активации NF-B в клетках А431. Накопление р65 в ядре через 30 мин воздействия ЭФР, по-видимому, не связано с присутствием в клетках А431 стресс-фибрилл и раффлов. В чем заключаются различия между пулом р65, направляемым в ядро, и пулом р65, ассоциированным с актинсодержащими структурами в цитоплазме, остается пока не выясненным.

Данные о том, что -актинин-4 может взаимодействовать в реакции in vitro с Nконцевой последовательностью RelA/р65, солокализуется с RelA/р65 в области стрессфибрилл, раффлов и пэтчей на всех стадиях реорганизации актинового цитоскелета, а также выявление этих белки в одних и тех же субклеточных фракциях, присутствие актинина-4 в ядре, где он может принимать участие в формировании В-специфичного ДНК-белкового комплекса, позволяет утверждать, что -актинин-4 является функциональным партнером р65 субъединицы NF-B и сопровождает RelA/р65 в процессе активации в цитоплазме и в ядре. Выявленные особенности локализации и распределения -актинина-1, его солокализация с р65 в цитоплазме, а также возможность прямого взаимодействия этих белков позволяют предположить, что -актинин-1 может участвовать в процессах, связанных с активацией NF-kВ. Однако вопрос о том, почему в мультибелковых комплексах после реакции иммунопреципитации с антителами к рвыявлялся только -актинин-4, как это было продемонстрировано ранее в Лаборатории биологии клетки в культуре, остается невыясненным и требует дальнейших исследований.

Выводы 1. В клетках А431 воздействие ЭФР, приводящее к реорганизации актинового цитоскелета, стимулирует накопление р65 в ядре, причем, ядерная транслокация рнаблюдается в условиях разборки актинового цитоскелета и не требует присутствия стресс-фибрилл и раффлов.

2. В цитоплазме под воздействием ЭФР наблюдается как связанное с F-актином перераспределение р65 (раффлы, стресс-фибриллы, пэтчи), так и независимое. Актинсодержащие зоны дискретной локализации р65 в цитоплазме (пэтчи), включающие актинин-1, -актинин-4, винкулин и паксиллин, описаны впервые.

3. Изоформы -актинина различаются между собой по локализации в разных компартментах клетки. Особенностью -актинина-1 является его локализация в перинуклеарной области, а -актинина-4 – на концах стресс-фибрилл и в ядре. На биохимическом уровне различия заключаются в выявлении разного набора укороченных форм -актининов, узнаваемых антителами к этим белкам, в цитоплазматических и ядерных подфракциях. В ядре -актинин-4 выявляется во всех ядерных подфракциях, тогда как -актинин-1 обнаруживается во фракции белков ядерной оболочки.

4. -Актинин является функциональным партнером р65 субъединицы NF-В в клетках А431, поскольку эти белки способны непосредственно взаимодействовать друг с другом, солокализуются в цитоплазме, могут обнаруживаться в одних и тех же подфракциях, и -актинин-4 может принимать участие в регуляции ДНК-связывающей активности NF-В.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Емельянов А.Н., А.В. Большакова, О.А. Петухова, Л.В. Туроверова, И.В. Кропачева, Г.П. Пинаев.

2005. Особенности распределения р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-B в клетках А431, распластанных на фибронектине, ламинине или антителах к рецептору ЭФР. Цитология. 47 (9): 808.

2. Petukhova O., A. Emelyanov, A. Bolshakova, L. Turoverova, V.Babakov, I.Kropacheva, K-E. Magnusson, G.Pinaev. 2005. Effect of EGF on redistribution of p65 NF-B/RelA in A431 cells spread on immobilized ligands. Abstracts the American Society for Cell Biology, 45 th Annual Meeting. 2005. p. 100a.

3. Большакова А., Е. Емельянов, О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев. 2006. Перераспределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-B в клетках А431 при восстановлении актинового цитоскелета и стимуляции ЭФР. Цитология. 48 (9): 4. Большакова А., О. Петухова, В. Бабаков, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П. Пинаев.

2006. Распределение изоформ альфа-актинина-1 и 4 в клетках А431. Цитология. 48 (9): 747.

5. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, V. Babakov, D. Tentler K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2006.

Adhesion induced actinin 1 and actinin 4 re-distribution in A431 spread on fibronectin and laminin 2/4.

Abstracts the American Society for Cell Biology, 46-th Annual Meeting.

6. Большакова А., О. Петухова, Л. Туроверова, Д. Тентлер, К.-Е. Магнуссон, Г.П Пинаев. 2007.

Структурно не связанный и связанный альфа-актинин в клетках А431. Цитология. Т49. С. 719-720.

7. Большакова А., О. Петухова. 2007. Анализ субклеточного распределения р65 субъединицы NF-B при воздействии ЭФР и адгезии клеток А431 к фибронектину. Материалы 11-й пущинской международной школы-конференции молодых ученых, 29 октября-2 ноября, Пущино. С. 71-72.

8. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, V. Babakov, D. Tentler, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2007.

Extra-cellular matrix proteins induce re-distribution of alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4 in A431 cells. Cell Biol. Int. 31. Р. 360-365.

9. Bolshakova A., O. Petukhova, L. Turoverova, D. Tentler, K-E. Magnusson, G. Pinaev. 2007. EGF influences the sub cellular distribution of alpha actinins and NFkB in A431 cells spread on fibronectin. The American Society for Cell Biology Meeting Abstracts. Mol. Biol. Cell 18 (suppl1): 484.

10. Petukhova O., Bolshakova A., Turoverova L., Tentler D., Magnusson K.-E., Pinaev G. 2008. The distribution of RelA/p65 in the cytoplasm is actin cytoskeleton-dependant but not its nuclear translocation in A431 cells stimulated with EGF. Abstracts of 33rd FEBS Congress and 11th IUBMB Conference. Athens, Greece, June, 29th –3rd July, PP4D-14, p.254.

11. Babakov, O. Petukhova, L. Turoverova, I. Kropacheva, D. Tentler, A. Bolshakova, E. Podolskaya, K-E.

Magnusson, G. Pinaev. 2008. RelA/NF-B transcription factor associates with -actinin-4. Exp. Cell Res. 314.

Р. 1030-1038.

12. Большакова А. В., Петухова О. А., Магнуссон К.–Е., Пинаев Г. П. 2008. Альфа актинины и NF-B совместно перераспределяются в клетках А431 в разных субклеточных компартментах. Материалы 4-го съезда биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая. С.16 (№269).

13. Большакова А., Петухова О. 2008. Альфа актинин 4 взаимодействует с N-концевой последовательностью RelA/р65 in vitro и может принимать участие в формировании специфических ДНК-белковых комплексов. Сборник тезисов 12-й Пущинской международной школы-конференции Молодых ученых, 10-14 ноября, Пущино. С. 8-9.

14. Большакова А. В., О. А. Петухова, Г. П. Пинаев, К.-Е. Магнуссон. 2009. Сравнительный анализ способов субклеточного фракционирования для выявления -актинина 1 и -актинина 4 в клетках А431.

Цитология. 51 (2): 122-129.

Список цитируемой литературы Бабаков В.Н. 2004. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

Бабаков В., Кропачева И., Петухова О., Туроверова Л., Пинаев Г.П. 2004. Цитология. 46(12): 1055-1063.

Бабаков В.Н., Бобков Д.Е., Петухова О.А., Туроверова Л.В., Кропачева И.В., Подольская Е.П., Пинаев Г.П.

2004. Цитология. 46(12): 1064-1072.

Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачёва И. В., Пинаев Г. П. 2004. Цитология. 46(1): 5-15.

Петухова О., Туроверова Л., Емельянов А., Кропачева И., Пинаев Г. 2005. Цитология. 47(2): 175-183.

Марзлав У. и Хуан Р. 1987. М: Мир. с. 111-115.

Araki N., Egamia Y., Watanabe Y., Hataea T. 2007. Exp. Cell Res. 313: 1496-1507.

Are A.F., Galkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. 2000. Exp. Cell Res. 256: 533-544.

Are A.F., Pinaev G.P., Burova E., Lindberg U. 2001. Cell Motil. and Cytoskeleton. 48: 24-36.

Bershadsky, A.D., Vasiliev, J.M. 1988. New York. Plenum Press: 298.

Blobel G., Potter V.R. 1966. Science. 154: 1662-1665.

Boyer L., Travaglione S., Falzano L., Gauthier N.C., Popoff M.R., Lemichez E., Fiorentini C., Fabbri A. 2004. Mol.

Biol. Cell. 15: 1124-1133.

Вradford M. M. 1976. Anal. Biochem. 72: 525-529.

Burgstaller G., Gimona M. 2004. J. Cell Sci. 117: 223-231.

Chapman N.R., Webster G.A., Gillespie P., Wilson B.J., Crouch D.H., Perkins N.D. 2002. Biochem. J. 366: 459-69.

Chakraborty S, Reineke E.L., Lam M., Li X., Liu Y., Gao C., Khurana S., Kao H.Y. 2006. JBC. 281: 35070-35080.

Chiang E.T., Lim M.J., Patton W.F., Shepro D. 2000. J. Biochem. Biophys. Methods. 46: 53—68.

Christerson L.B., Vanderbilt C.A., Cobb M.H. 1999. Cell Motil Cytoskeleton. 43:186-198.

Clark K.A., McElhinny A.S., Beckerle M.C., Gregorio C.C. 2002. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 18: 637–706.

Communal C., Sumandea M., de Tombe P., Narula J., Solaro R.J., Hajjar. 2002. PNAS. 99: 6252-6256.

Demczuk S., Harbers M., Vennstrom B. 1993. Proc.Natl.Acad.Sci. 90: 2574-2578.

Dent C.L., Smith M.D., Latchman D.S. 1999. Pract. Approach 2-nd Ed. Latchman D.S. Oxford. University Press.

Dwyer N., Blobel G. 1976. The J. Cell Biol. 70: 581-591.

Fazal F., Minhajuddin M., Bijli K.M., McGrath J.L., Rahman A. 2007. JBC. 282(6): 3940–3950.

Goffart S., Franko A., Clemen C.S., Wiesner R.J. 2006. Current Genetics. 49: 125-135.

Honda K., Yamada T., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. 1998. The Journal of Cell Biology. 140(6): 1383-1393.

Hynes R.O. 1999. Trends Cell Biol. 9(12): 33-37.

Immure M., Endo T., Kuroda M., Tanaka T., Masaki T. 1988. JBC. 263: 7800-7805.

Kaverina I., Stradal T.E., Gimona M.. 2003. J. Cell Sci. 116: 4915-4924.

Kustermans G., Piette J., Legrand-Poels S. 2008. Biochem. Pharmacol. 76(11): 1310-22.

Laemmli U.K. 1970. Nature. 227: 680-685.

Legrand-Poels S., Kustermans G., Bex F., Kremmer E., Kufer T. A., Piette J. 2007. J. of Cell Sc. 120: 1299-1310.

Linder S., Aepfelbacher M. 2003. Trends in Cell Biol. 13: 376-385.

Lock J.G., Wehrle-Haller B., Strmblad S. 2008. Semin Cancer Biol. 18(1): 65-76.

Luikart S., Masri M., Wahl D., Hinkel T., Beck J.M., Gyetko M.R., Gupta P., Oegema T. 2002. Biochim Biophys Acta. 1591: 99-107.

Narayanan R., Klement J.F., Ruben S.M., Higgins K.A., Rosen C.A. 1992. Science.256: 367-370.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»