WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Сравнительный анализ распределения изоформ -актинина в клетках и выделенных субклеточных фракциях [4, 5, 6, 8, 14] Иммунофлуоресцентный анализ показал, что обе изоформы -актинина в клетках, распластанных на фибронектине, солокализуются со стресс-фибриллами и диффузно распределяются по цитоплазме клеток. Особенностью -актинина-1 является его локализация в околоядерной области. Актинин-4 обнаруживался в ядре и, более плотно, на концах стресс-фибрилл (рис.4).

После воздействия на клетки ЭФР солокализация -актининов со стресс-фибриллами сохранялась, обе изоформы обнаружены также в раффлах, что подтверждает полученные ранее данные (Бабаков и др., 2004). Локализация -актининов на стресс-фибриллах была показана также другими авторами (Honda et al., 1998). Особенностью настоящей работы является обнаружение -актинина-4, в отличие от -актинина-1, на концах стрессфибрилл. Эти данные отличаются от результатов работы Хонды и соавторов, проведенной на фибробластах эндометрия матки, где -актинин-1 обнаруживался на концах стрессфибрилл (Honda et al., 1998). Такое несоответствие может быть связано с особым характером распределения -актининов в клетках эпителиального ряда. Другой причиной может служить влияние адгезии к фибронектину, приводящее к перераспределению актинина-4 в области фокальных контактов, как это было сделано в настоящей работе.

Рис.4. Распределение актинина-1 и -актинина-4 в клетках А431, распластанных на фибронектине.

Окраска антителами к актинину-1 и -актинину-4 (зеленый).

F-актин окрашивали родаминфаллоидином (красный). Стрелкой указана локализация -актинина-1 в перинуклеарной области, актинина-4 в ядре и на концах стресс-фибрилл. Объектив Отличия в распределении -актинина-1 и -актинина-4 в клетках А431 были выявлены путем субклеточного фракционирования. Для этого клетки фракционировали с получением суммарной цитоплазматической фракции, ядерной фракции белков, экстрагируемых 0.4 M NaCl, обогащенной транскрипционными факторами, и фракции белков, «прочно связанных с хроматином».

Было также проведено фракционирование ядер другим способом с получением фракции белков нуклеоплазмы, тритон-растворимых белков ядерной оболочки, белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей и белков комплекса ядерной ламины. В цитоплазме клеток, культивируемых на пластике, выявлялся только полноразмерный актинин-1 в отличие от -актинина-4, для которого было характерно присутствие укороченной формы ~75 кДа. Перевод клеток в суспензионное состояние и адгезия к фибронектину приводили к появлению укороченной формы -актинина-1 в этой фракции (рис.5, А).

Рис. 5. Особенности распределения актинина-1 и -актинина-4 в субклеточных фракциях клеток А431.

Вестерн-блот-анализ. А – цитоплазма.

Влияние адгезии к фибронектину. Б-. – ядерная фракция 0.4 M NaCl. В – фракция белков, «прочно связанных с хроматином». Г – ядерные подфракции. ПЛ - клетки, культивируемые на пластике, С – клетки в суспензионном состоянии, ФН – клетки, распластанные на фибронектине. D1S (нуклеоплазма), D2TS (тритон-растворимая фракция белков ядерной оболочки). D2TSs (фракция белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей) и D2TSp (фракции белков комплекса ядерной ламины).

-Актинин-4 стабильно выявлялся в ядре. В ядерной фракции белков, экстрагируемых 0.4 M NaCl, обогащенной транскрипционными факторами, и фракции белков, «прочно связанных с хроматином», обнаруживался полноразмерный -актинин-4, фрагмент с мол. массой ~65 кДа, а также высокомолекулярный белок с мол. массой ~150 кДа (рис.5, Б, В). Фракционирование ядер другим способом показало присутствие -актинина-4 во всех ядерных подфракциях.

Ситуация с выявлением -актинина-1 в ядре оказалась более сложной, в отдельных экспериментах можно было обнаружить полноразмерный -актинин-1 либо его фрагмент (рис.5, Б). В случае фракционирования ядер другим способом -актинин-1 обнаруживался в тритон-растворимой фракции ядерной оболочки и фракции комплекса ядерной ламины и отсутствовал во фракции нуклеоплазмы и фракции ядерных белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей. Эти особенности распределения могут быть связаны с тем, что -актинины принадлежат к белкам цитоскелета, и при использовании различных буферных растворов для лизиса клеток цитоскелетная фракция может загрязнять ядерную фракцию. В нашем случае буферные растворы различаются присутствием Тритона Х-100.

Так, при фракционировании ядер другим способом по методу Двайера и Блоубела (Dwyer, Blobel, 1976) Тритон Х-100 отсутствовал; вероятно, в этом случае сохранялась связь актинина-1 с ядерной мембраной (рис.5, Г).

Вероятно, тесное взаимодействие -актинина-1 с ядерной оболочкой является общим свойством для спектринсодержащих белков. Исследования последних лет показали, что в наружной мембране ядерной оболочки присутствуют белки несприны, имеющие актинин–подобный актинсвязывающий домен (Zhang et al., 2001, Young, Kothary, 2005).

Присутствие -актинина-4 в ядре показано всеми применяемыми способами, подтверждает данные, ранее полученные в лаборатории, и данные других авторов и не вызывает сомнений (Бабаков и др., 2004; Poch et al., 2004, Chakraborty et al., 2006).

Совокупные результаты, полученные при сравнении нескольких биохимических методов и иммунофлуоресцентного анализа, свидетельствуют о том, что помимо того, что -актинины являются типичными белками цитоплазмы, -актинин-1 прочно связан с мембраной ядерной оболочки, а -актинин-4 является лабильным белком и может присутствовать в разных ядерных подфракциях.

Совместное распределение -актинина-1 и -актинина-4 в и р65 субъединицы NFB в клетках А431 [9, 11, 12].

Рис.6. Совместное распределение р65, -актинина-1 и -актинина-4 в клетках А431, распластанных на фибронектине и после добавления ЭФР. Иммунофлуоресцентный анализ.

Окраска антителами к -актинину-1 и актинину-4 (красный), и к р65 (зеленый).

Области солокализации (красные) выявлены с помощью программы Image J.

Объектив 63.

Результаты иммунофлуоресцентного анализа приведены на рис.6. Области солокализации р65 субъединицы NF-B с -актинином-1 или 4, выявленные с помощью программы Image J, представлены на рис.6 как области, окрашенные красным цветом. Солокализация этих белков выявляется в области стресс-фибрилл, а после воздействия ЭФР – в раффлах.

Присутствие -актинина-1 и актинина-4 в дискретных областях, содержащих р65, в цитоплазме (пэтчах), возникающих после воздействия ЭФР, было представлено ранее на рис.3.

Для того, чтобы проверить совместное присутствие этих белков в разных субклеточных фракциях, было проведено субклеточное фракционирование с использованием коммерческого набора (Qiagen) с получением фракций свободных белков цитоплазмы, мембранных белков, ядерных и цитоскелетных белков (рис.7). Мы обнаружили присутствие р65, -актинина-1 и -актинина-4 во всех анализируемых фракциях.

Особенность заключалась в разном наборе белков, узнаваемых антителами к исследуемым белкам.

Полноразмерный р65 был обнаружен во всех субклеточных фракциях. Во фракции свободных белков цитоплазмы антитела к р65 узнавали, кроме того, высокомолекулярный белок с мол. массой около 150 кДа. Укороченные формы р65 обнаруживались во всех фракциях кроме цитоскелетной. Цитоскелетная фракция также характеризовалась присутствием белка с мол. массой ~100 кДа (рис.7). Полноразмерный -актинин-1 был обнаружен во всех субклеточных фракциях, в том числе в ядерной. Мы полагаем, что это связано с тем, что ядерная фракция может содержать белки ядерной оболочки.

Укороченная форма -актинина-1 с мол. массой ~75 кДа выявлялась в двух фракциях:

цитоплазматических и мембранных белков. В отличие от -актинина-1, как полноразмерный -актинин-4, так и укороченная форма ~75 кДа были обнаружены во всех фракциях.

Фракции свободных белков цитоплазмы и мембранных белков были обогащены этим фрагментом. Кроме того, во фракциях цитоплазматических, мембранных и ядерных белков выявлялся фрагмент ~65 кДа. В ядерной фракции обнаружили также фрагмент ~55кДа.

Рис.7. RelA/p65, -актинин-1 и -актинин-4 в субклеточных фракциях, полученных с помощью коммерческого набора фирмы Qiagen.

Вестерн-блот-анализ фракции свободных белков цитоплазмы (А), мембранных белков (Б), ядерных белков (В) и белков цитоскелета (Г) клеток, распластанных на фибронектине.

Таким образом, субклеточное фракционирование позволило выявить дополнительные различия в распределении изоформ -актинина, показывая особый характер состава цитоскелетной фракции и демонстрируя особенности распределения укороченных форм всех исследуемых белков.

Роль укороченных форм -актинина и р65 в клетках А431 остается пока не выясненной, хотя данные о появлении фрагмента ~75 кДа -актинина-1 в суммарной цитоплазматической фракции после распластывания клеток А431 на фибронектине (см.

рис.5) могут свидетельствовать о взаимосвязи процессов адгезии и образования фрагментов.

Существование фрагментов RelA/p65 было показано для различных типов клеток. В литературе описаны фрагменты р65 с мол. массами 53-55 кДа, 42-45 кДа и 37 кДа (Chapman et al., 2002). Подобные укороченные формы р65 были найдены в эндотелиальных клетках, миеломоноцитах, Т-клетках, клетках костной ткани, HeLa и других клетках (Narayanan et al.,1992; Ruben et al., 1992).

Образование укороченных форм -актинина было показано другими авторами in vivo и доказано их важное физиологическое значение (Selliah et al., 1996; Pavalko et al., 1998;

Communal et al., 2002; Luikart et al., 2002). Фрагменты могут быть получены in vitro при протеазном расщеплении -актинина трипсином, термолизином и химотрипсином (Immure et al., 1988; Communal et al., 2002).

Прямое взаимодействие RelA/р65 и -актинина [13].

На вопрос о прямом взаимодействии белков можно ответить с использованием метода GST pull-down. Данный метод заключается в изучении взаимодействия белков, иммобилизованных на GST-сефарозе, с очищенными белками. E. coli трансформировали плазмидами pGEX 4Т-1, содержащими N-концевую последовательность р(аминокислоты 1-357) и C- концевую последовательность р65 (аминокислоты 308-550).

После индукции IPTG белки, сшитые с глютатион S –трансферазой (GST), были очищены из клеточных лизатов с помощью аффинной хроматографии на глютатион-сефарозе. Для взаимодействия N- и С- концевой последовательности р65 были использованы очищенные белки, обогащенные -актинином-1, или -актинином-4.

Результаты вестерн-блот-анализа после разделения реакционной смеси в системе SDSэлектрофореза, приведенные на рис.8, демонстрируют, что только N-концевая последовательность взаимодействует с -актинином. Причем, установлено взаимодействие как с -актинином, выделенным их почек свиньи (-актинин-4), так и с актинином, выделенным из желудков цыплят (-актинин-1). Таким образом, специфичность по отношению к одному из -актининов выявить не удалось. Это подтверждает полученные ранее данные о том, что р65 обнаруживается среди белков, взаимодействующих с иммобилизованным -актинином, выделенным из желудков цыплят (-актинином-1) (Бабаков, 2004).

Рис. 8. Анализ взаимодействия N- и C-концевых доменов р65, иммобилизованных на глютатион-сефарозе, с -актинином (метод GST pulldown).

Вестерн-блот-анализ с антителами к -актинину-1 и -актинину-4.

А - Контроль без добавления -актининов к GST-сефарозе. Б – взаимодействие с -актинином-1. В взаимодействие с -актинином-4. На дорожки наносили уменьшающиеся количества глютатион-сефарозы (1, 2, 3). pGex – контроль, не содержащий последовательности р65.

Возможность участия -актинина-4 в реакции ДНК-связывания NF-B с консенсусными последовательностями В [13].

Данные в пользу того, что -актинин может являться кофактором NF-B, впервые были исследованы в Лаборатории биологии клетки в культуре (Бабаков и др., 2004). В литературе описаны белки, кофакторы транскрипционного фактора NF-B, участвующие в регуляции NF-B-зависимых генов. Более подробно роль белков-коактиваторов описана для HMG 1(Y), c-jun, ATF-2, IRF (IFN regulated factor) (Thanos, Maniatis, 1995), CREBсвязывающего белка (CBP/300). Некоторые из кофакторов выполняют репрессирующую функцию, например, гистоновая деацетилаза – 1, 2 (HDAC-1, 2) (Zhong et al., 1998, 2002), белки HSCO, SINC (Owen et al., 2005). Взаимодействие с RelA/р65 показано для CBP, p300, TBP, TAF, TFIIB.

Для -актинина-4 показано взаимодействие с фактором транскрипции NF-Y (Poch et al., 2004), участие в активации транскрипционного фактора MEF-2 путем негативной регуляции активности HDAC7 (Chakraborty et al., 2006) и способность образовывать ДНКбелковые комплексы на промоторе цитохрома С (Goffart et al., 2006).

Для проверки предположения о том, что -актинин является кофактором NF-B на уровне ДНК-связывающей активности и может входить в состав B-специфичных ДНКбелковых комплексов, в настоящей работе использовали метод торможения ДНКбелковых комплексов в геле и конкурентный анализ, а также сочетание методов торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блота (shiftwestern). ДНК-связывающая активность характеризует первый этап регуляции экспрессии генов и является важным функциональным свойством транскрипционного фактора.

В предыдущих работах Лаборатории биологии клетки в культуре в ядерных экстрактах было выявлено формирование трех B-специфичных ДНК-белковых комплексов, различающихся по подвижности в ПААГ (Петухова и др., 2005). Комплексы II и III стабильно выявлялись в активированных клетках. Комплекс I с наименьшей электрофоретической подвижностью выявлялся нестабильно, и закономерности его появления не удалось выяснить.

Результаты конкурентного анализа показали, что комплекс II содержит р65, поскольку добавление антител к р65 приводило к торможению подвижности B-специфичного комплекса II (супершифту) (рис.9, А). Комплекс III, по-видимому, не содержит р65, поскольку при добавлении антител к р65 интенсивность этого комплекса не менялась.

Если в экстрактах присутствует комплекс III, то добавление антител к -актинину-приводило к исчезновению этого комплекса, что указывает на присутствие в нем актинина-4, снижалась также интенсивность комплекса II (рис.9, А). Анализ с антителами к р50 субъединице показал, что комплекс II содержит также и р50, поскольку наблюдался супершифт и снижение его интенсивности. Тот факт, что при добавлении равного количества антител к р65 и р50 в реакцию антитела к р50 не приводили к исчезновению комплекса II, может свидетельствовать о том, что кроме комплекса р65/р50 (классический NF-B) в состав этого комплекса входят и другие белки.

Рис. 9. Анализ состава Вспецифичных ДНК-белковых комплексов.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»