WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Получение ядерных подфракций по методу Двайера и Блоубела с модификациями (Dwyer, Blobel, 1976). Для лизиса клеток использовали буфер: 250 мМ сахарозы, 1 мM MgCl2, 2 мM ЭДТА, 25 мM трис НСl pH 7.2, 1 мM ДТТ, 1 мM PMSF, 1 мM Na3VO4, коктейль ингибиторов протеаз (Blobel, Potter, 1966; Бабаков и др., 2004). Ядра осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 0.1 мM MgCl2 с последующим добавлением ДНКазы I (100 мкг/мл), 10 % сахарозы, 10 мM триэтаноламина (ТЭА) pH 8.5 и 0.1 мM о MgCl2 (20 мин, 22 С). Смесь центрифугировали через 30 %-ную сахарозу (18000 g, 10 мин о при +4 С). Надосадочная жидкость содержала белки нуклеоплазмы (D1S). Эту процедуру повторяли дважды. Тритон–растворимую фракцию белков ядерной оболочки (D2TS) экстрагировали в буфере: 10 % сахарозы 10 мМ ТЭА pH 7.5, 0.1 мМ MgCl2 и 2 % Тритона о о Х-100 (10 мин при +4 С) и центрифугировали 10 мин при 18000 g и +4 С. Осадок ресуспендировали буфером, содержащим 10 % сахарозы, 10 мМ ТЭА pH 7.5, 0.1 мМ MgCl2 и 2 % Тритона Х-100, далее добавляли 2 M NaCl, 100 мM ТЭА pH 7.5 для получения белков, экстрагируемых высокими концентрациями солей (D2TSs), после центрифугирования осадок содержал белки комплекса ядерной ламины (D2TSp).

Фракционирование с помощью коммерческого набора (Qiagen, Германия) с получением фракций несвязанных цитоплазматических белков, мембранных белков, белков, связанных с цитоскелетом, и белков ядерной ламины проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Иммуноблотинг белковых экстрактов клеток проводили по стандартной методике (Towbin et al., 1979). Антитела к р65 субъединице NF-B, -актинину-1 и -актинину-использовали в разведении 1:1000, вторые антитела – в разведении 1:2000 (Dako).

Получение меченых двуцепочечных ДНК зондов (Fermentas). Реакцию мечения специфического олигонуклеотида (5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’) проводили в соответствии с рекомендациями фирмы Fermentas. Использовали g-32 Р-АТФ фирмы Amersham (Швеция) и Т4 полинуклеотидкиназу фирмы Fermentas (Литва).

Радиоактивность определяли на счетчике фирмы Beckman. Для получения двуцепочечного фрагмента ДНК проводили отжиг меченых олигонуклеотидов с комплементарными немечеными олигонуклеотидами в 0.1 М NaCl: смесь нагревали до о С и давали остыть до tкомн.

Анализ ДНК-связывающей активности ядерных экстрактов методом торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (Dent et al., 1999).

Реакцию связывания специфического меченого олигонуклеотида с белками ядерных экстрактов проводили в буферном растворе 50 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 10 мМ MgCl2, 10% глицерина, 0.5 мM ДТТ в присутствии 1000-кратного избытка неспецифического конкурента (poly[dI-dC]) в течение 20 мин, tкомн. В реакцию брали не менее 30000 имп/мин меченого олигонуклеотида и 7 мкг ядерного экcтракта. При конкурентном анализе в реакцию добавляли антитела к р65 и р50 субъединицам NF-B или -актинину-4 (20 мин, tкомн). ДНК-белковые комплексы разделяли в нативном 4 %-ном ПААГ в трис-ацетатном буфере при 100 В. Высушенные гели экспонировали с рентгеновской пленкой фирмы Kodak в течение необходимого времени.

Сочетание методов торможения подвижности ДНК-белковых комплексов в геле и вестерн-блот-анализа (Demczuk et al., 1993). Реакция связывания и разделения ДНКбелковых комплексов проводили так же, как описано выше. После переноса в трисглициновом буфере, содержащем 20 % метанола и 0.1 % SDS с помощью установки для переноса (BioRad, США), белковый компонент связывался с нитроцеллюлозой, а ДНК – с мембраной ДЕ81. После переноса нитроцеллюлозу блокировали 5 %-ным обезжиренным сухим молоком и инкубировали с первыми и вторыми антителами. Для усиления сигнала использовали систему хемилюминесценции ECL. Хемилюминесцентное излучение регистрировали с помощью рентгеновской пленки. Мембрану ДЕ81 экспонировали с рентгеновской пленкой.

Метод GST-pulldown. Для анализа прямого взаимодействия N-или C- концевых доменов р65 субъединицы с очищенными белками, -актинином-1 и -актинином-использовали рекомендации фирмы Amersham.

Для экспрессии в E. coli, штамм BL21 использовали плазмиды pGEX 4Т-1, содержащие N-концевую последовательность р65 (аминокислоты 1-357) и C-концевую последовательность р65 (аминокислоты 308-550), сшитые с глютатион S – трансферазой (GST). После индукции IPTG белки, иммобилизованные на глютатион-сефарозе (Amersham), были очищены из клеточных лизатов с помощью аффинной хроматографии.

Реакцию связывания иммобилизованных N- и C- концевых последовательностей р65 с выделенными белками, -актинином-1 и -актинином-4, проводили в буферном растворе PBS. -Актинин, выделенный из желудков цыпленка, обогащенный -актинином-1, и актинин, выделенный из подоцитов почек свиньи, обогащенный -актинином-4, любезно предоставлены В.Н. Бабаковым. К различным аликвотам сефарозы с пришитыми последовательностями р65 добавляли по 20 мкг очищенных белков, -актинина-1 или актинина-4, и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 1 ч при +4С.

Сефарозу многократно отмывали от несвязавшихся белков растворами 1 %-ного Тритона Х-100/PBS и PBS и анализировали связавшиеся белки с помощью электрофореза (Laemmli, 1970) и вестерн-блота с окраской антителами к р65 субъединице, -актинину-или -актинину-4.

Анализ ДНК-связывающей активности выделенных белков методом торможения подвижности ДНК в геле (in vitro band-shift). Для получения свободных N- или Cконцевых последовательностей р65 субъединицы в растворе GST-сефарозу, содержащую N- и C-концевые домены р65, инкубировали с тромбином (0.125 ед/мкл) в течение ночи.

Реакцию связывания N- и C- доменов р65 со специфическим меченым олигонуклеотидом проводили как описано выше. Очищенный -актинин добавляли непосредственно в реакцию связывания N-концевого р65 с В-специфической последовательностью ДНК.

Статистическая обработка данных. Электрофореграммы после иммуноблотинга и in vitro band-shift анализировали с помощью программы Scion image. В подсчетах средних значений и 95 %-ных доверительных интервалов использовали программу Microsoft Excel.

Солокализацию белков после иммунофлуоресцентного анализа проводили с использованием программы Image J. Области перекрывания белков и ДНК-белковых комплексов после анализа методом shift-western получены с использованием программы Adobe Photoshop.

Результаты и обсуждение Распределение RelA/p65 в клетках А431 при адгезии к фибронектину и воздействии ЭФР [1, 2, 3, 7, 10]. Распластывание на фибронектине приводило к формированию стрессфибрилл у большинства клеток в популяции, создавая единообразную структуру актинового цитоскелета (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004). Под влиянием ЭФР наблюдалась согласованная реорганизация актинового цитоскелета, заключающаяся в расхождении существующих стресс-фибрилл к краям клеток и частично к их разборке и в последующем восстановлении стресс-фибрилл по всему телу клеток.

На рис.1 представлено распределение р65 и F-актина в клетках А431, распластанных на фибронектине. Приведены вертикальные и горизонтальные срезы. Можно видеть, что робнаруживается солокализованно со стресс-фибриллами и диффузно (независимо от актиновых филаментов) в цитоплазме, причем более плотно в перинуклеарной области, а также в ядре (рис.1, А, А’). Воздействие ЭФР в течение 5 мин, когда происходит реорганизация актинового цитоскелета и образуются дорзальные раффлы, робнаруживается в дорзальных раффлах (рис.1, Б – апикальный срез). Р65, окрашиваемый независимо от F-актина (диффузно), перераспределяется по направлению к краю клеток, как это можно видеть на срезе, сделанном в вентральной области клеток (рис.1, Б, б).

Через 30 мин воздействия ЭФР RelA/р65 наблюдается солокализованно со стрессфибриллами и накапливается в ядре, а также распределяется диффузно по всей цитоплазме (рис.1, В). Солокализацию на стресс-фибриллах, полученную с помощью программы Image J, можно видеть на рис.1, А’, Б’, В’, где представлены срезы в вентральной области клеток (красные). Солокализация р65 со стресс-фибриллами в клетках после 30-мин воздействия ЭФР представлена на рис.1, Д после экстракции свободных белков цитоплазмы и мембранных белков.

Р65 также обнаруживался в дискретных областях в цитоплазме, солокализованно с Fактином. Эти области, обозначенные рамкой на рис.1, В, представлены более детально на рис.1, Г, на срезе, проведенном ближе к апикальной поверхности клетки по сравнению с рис.1, В, где видно, что актин в этих зонах расположен в виде «клубка» и, по-видимому, р65 расположен внутри этого «клубка».

Таким образом, на всех стадиях реорганизации актинового цитоскелета, вызванных адгезией к фибронектину и воздействием ЭФР, RelA/p65, помимо диффузного распределения, выявлялся солокализованно с актин-содержащими структурами разных типов.

Возник вопрос, не может ли происходить транслокация RelA/p65 в ядро под влиянием ЭФР с помощью этих лабильных структур F-актина. Одним из фактов в пользу участия раффлов в активации и транспорте RelA/p65 служат данные других авторов (Boyer et al., 2004). Образование дорзальных раффлов в нашем случае характерно для клеток после мин воздействия ЭФР. Их формирование в клетках А431 было показано другими авторами после 1-5 мин стимуляции ЭФР (Araki et al., 2007). Накопление р65 в ядре под влиянием ЭФР мы выявляли методом иммуноблота.

Рис.1. Распределение RelA/р65 и Fактина в клетках А431 под влиянием фибронектина и ЭФР.

Иммунофлуоресцентный анализ. Окраска антителами к р65 (зеленый) и Родаминфаллоидином (красный). А - клетки, распластанные на фибронектине 1 ч. Б - 5 мин ЭФР, срез в апикальной области, б- срез в вентральной области. В - 30 мин ЭФР. Г – области дискретной локализации р(увеличено). n - срез в области ядра Стрелками указаны области солокализации (желтый). А’, Б’, В’ – солокализация выявлена с помощью программы Image J (красный), срезы в вентральных областях клеток. Д – локализация р65 на стресс-фибриллах после экстракции белков цитоплазмы и мембранных белков.

Объектив 63.

В цитоплазматической фракции не выявлены изменения доли р65 ни в клетках, культивируемых на пластике, ни в клетках, распластанных на фибронектине. Доля р65 во фракции белков, экстрагируемых 0.4 M NaCl, в клетках, культивируемых на пластике, увеличивалась в 5 раз под влиянием ЭФР (рис.2, А), тогда как в клетках, распластанных на фибронектине, наблюдалось увеличение в 2.5 раза (рис.2, Б), поскольку само по себе распластывание на фибронектине сопровождалось увеличением доли р65.

Воздействие ЦХ Д на клетки приводило к разрушению актинового цитоскелета и образованию агрегатов актина. Удаление ЦХ Д и добавление ДМЕМ сопровождалось восстановлением стресс-фибрилл, тогда как добавление ЭФР препятствовало их восстановлению; F-актин в этом случае был представлен крупными агрегатами. Если ЭФР добавляли непосредственно в среду, содержащую ЦХ Д, то не наблюдалось даже образования крупных агрегатов, весь F-актин был представлен мелкими агрегатами по всему телу клеток.

Рис.2. Накопление RelA/р65 в ядре под воздействием ЭФР.

Вестерн-блот-анализ. А- клетки, культивируемые на пластике. Б- клетки, распластанные на фибронектине. В – клетки, распластанные на фибронектине (К, 1), обрабатывали ЦХ Д (2) для разрушения актинового цитоскелета, после чего заменяли среду, содержащую ЦХ Д, на чистую ДМЕМ (3, 6) или ДМЕМ, содержащую ЭФР (4, 7) или ЭФР в присутствии ЦХ Д (5, 8). На диаграммах приведены численные значения интенсивности полосы белка с подвижностью 65 кДа. Количественный анализ проводили с использованием программы Scion Image.

На диаграммах оси ординат – интенсивность полосы, усл.ед. р<0.05, n=3.

Раффлы в этом случае не были обнаружены. Вестерн-блот-анализ показал, что накопление р65 в ядре происходило только в случае добавления ЭФР, как в присутствии ЦХ Д, так и без него (рис.2, В).

Следует отметить, что самого по себе восстановления актиновых филаментов в отсутствие стимуляции клеток ЭФР оказалось не достаточно для транспорта RelA/p65 в ядро.

Таким образом, опыты с ЦХ Д доказали, что транслокация р65 в ядро не зависит от наличия стресс-фибрилл и раффлов.

Особого внимания заслуживают области дискретной локализации RelA/p65 (пэтчи).

Как показано на рис.1, F-актин в пэтчах расположен в виде «клубка», а робнаруживается внутри этого «клубка» по всей толщине клетки, поскольку р65 можно видеть как на вентральных, так и на апикальных срезах. Таким образом, конфокальные срезы показали возможность контакта р65 в этих областях с основанием клетки, что предполагает связь этих структур с клеточной адгезией.

Рис. 3. Актин-содержащие зоны дискретной локализации RelA/p65 в цитоплазме (пэтчи) клеток, распластанных на фибронектине после воздействия ЭФР.

Иммунофлуоресцентный анализ.

Окраска антителами к -актинину-1, -актинину-4, паксиллину, винкулину (красный) и RelA/р(зеленый). Стрелками указаны зоны дискретной локализации р65.

Масштабный отрезок – 8 мкм.

Объектив 63.

Чтобы проверить это предположение, был проведен иммунофлуоресцентный анализ с антителами к белкам, характерными для комплексов фокальной адгезии. Данные, приведенные на рис.3, демонстрируют присутствие -актинина-1, -актинина-4, винкулина и паксиллина в этих областях. Такие белки характерны для еще одного типа динамичных F-актинсодержащих структур, подосом, которые впервые были описаны в трансформированных фибробластах (Linder, Aepfelbacher, 2003, Varon et al, 2006). Как было показано, подосомы постоянно разбираются и собираются в клетке около концов стресс-фибрилл, в области, граничащей с комплексами адгезии (Kaverina et al., 2003; Burgstaller, Gimona, 2004).

Подосомы отличаются от фокальной адгезии присутствием металлопротеаз, однако методом иммунофлуоресценции мы не обнаружили присутствия этих ферментов. Данных, свидетельствующих о присутствии RelA/p65 в подосома-подобных структурах, в литературе найти не удалось. Следовательно, вопрос о природе пэтчей пока остается открытым; вероятнее всего, они связаны с фокальной адгезией (Sastry, Burridge, 2000;

Lock et al., 2008).

Очень важно, что размеры дискретных зон, в которых обнаружена солокализация р65 с белками адгезии, увеличивались, если ЭФР добавляли к клеткам, актиновый цитоскелет которых был разрушен ЦХ Д. Подобные зоны мы стабильно обнаруживали в клетках, распластанных на фибронектине, после добавления ЭФР. Полученные данные позволяют предположить, что р65 накапливается в этих областях под влиянием ЭФР. Следовательно, присутствие р65 в дискретных актин-содержащих областях цитоплазмы, включающих белки, характерные для фокальной адгезии, является одним из этапов активации NF-B в клетках А431.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»