WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

БОЛЬШАКОВА Анастасия Викторовна РАСПРЕДЕЛЕНИЕ Р65 СУБЪЕДИНИЦЫ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА NF-B И ИЗОФОРМ -АКТИНИНА В СВЯЗИ С РЕОРГАНИЗАЦИЕЙ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ А431 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009 1

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук.

Институт цитологии РАН

Научный консультант: кандидат биологических наук Ольга Александровна Петухова Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Елена Сергеевна Корнилова Институт цитологии РАН доктор биологических наук Надежда Владимировна Кулёва Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Ведущая организация: Институт канцерогенеза РОНЦ им. Блохина

Защита состоится 22 мая 2009 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru сайт: http://www.cytspb.rssi.ru факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан 22 апреля 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В. Каминская 2

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Одной из активно развивающихся областей современной клеточной биологии является изучение роли актинового цитоскелета в передаче сигнала и регуляции экспрессии генов.

Актиновые филаменты вместе с микротрубочками и промежуточными филаментами образуют динамическую сеть в цитоплазме клеток, называемую цитоскелет, которая определяет форму клетки и лежит в основе клеточной миграции, участвует в межклеточной адгезии и адгезии клеток с матриксом (Bershadsky, Vasiliev, 1988; Hynes, 1999; Clark et al., 2002). Имеются данные, свидетельствующие об участии актинового цитоскелета в процессах проведения внутриклеточного сигнала. В частности, некоторые сигнальные молекулы способны непосредственно взаимодействовать с белками актинового цитоскелета на определенных этапах передачи сигнала от клеточной мембраны к ядру (Yamada, Geiger, 1997; Otey, Carpen, 2004; Legrand-Poels et al., 2007).

Однако, по-прежнему, остаются невыясненными точные механизмы, с помощью которых актиновый цитоскелет принимает участие в сигнальных каскадах и регуляции экспрессии генов.

Ряд данных говорит о том, что реорганизация актинового цитоскелета может приводить к изменению активности транскрипционных факторов (Sotiropoulos et al., 1999; Fazal et al., 2007; Kustermans et al., 2008). Реорганизация актинового цитоскелета происходит под влиянием ростовых факторов, межклеточной адгезии и адгезии клеток к субстрату, осуществляемой, главным образом, интегриновыми рецепторами. В то же самое время, факторы, вызывающие реорганизацию актинового цитоскелета, регулируют также активность транскрипционных факторов (Schoenwaelder, Burridge, 1999). Вероятно, реорганизация актинового цитоскелета сопровождается перегруппировкой белков актинового цитоскелета, входящих в состав сигнальных комплексов и взаимодействующих с транскрипционными факторами. Одним из таких транскрипционных факторов, регуляция которого может осуществляться в связи с реорганизацией актинового цитоскелета, является NF-B (Fazal et al., 2007, Nemeth et al., 2004).

Дополнительными фактами, указывающими на участие актинового цитоскелета в регуляции экспрессии генов, является открытие внутриядерных функций актина и актинсвязывающих белков. Однако эти вопросы остаются, по-прежнему мало изученными.

Одним из таких белков, способных взаимодействовать с транскрипционными факторами, является -актинин (Poch et al., 2004; Goffart et al., 2006).

Настоящая работа является частью исследования, проводимого в Лаборатории биологии клетки в культуре в течение многих лет. Ранее в лаборатории было показано, что р65 субъединица NF-B солокализуется со стресс-фибриллами в цитоплазме фибробластов и при разрушении актинового цитоскелета р65 субъединица NF-B остается связанной с агрегатами актина. Кроме того, р65 субъединица NF-B обнаруживалась в числе белков клеточных экстрактов, взаимодействующих с иммобилизованным F-актином (Are et al., 2000). Поиск белков, которые могут взаимодействовать как с актином, так и с р65 субъединицей NF-B, указал на -актинин, поскольку имеются данные о том, что киназа MEKK1, которая является одним из активаторов NF-B, способна напрямую взаимодействовать с -актинином in vitro (Christerson et al., 1999). В немышечных клетках встречаются две изоформы -актинина: -актинин-1 и -актинин-4. Особенностью актинина-4 является его способность транслоцироваться в ядро, где он может взаимодействовать с промоторами генов (Goffart et al., 2006) и выступать как кофактор транскрипции (Chakraborty et al., 2006). Исследования Лаборатории биологии клетки в культуре показали солокализацию р65 субъединицы NF-B и -актининов в цитоплазме клеток А431, в особенности в области дорзальных раффлов. Более того, -актинин-4 был обнаружен в ядре (Бабаков и др., 2004). Несмотря на солокализацию обоих -актининов и р65, в мультибелковых комплексах ядерных и цитоплазматических экстрактов после реакции иммунопреципитации с антителами к р65 субъединице NF-B выявлялся только -актинин-4 (Бабаков, 2004). Поэтому возникла необходимость детального исследования областей солокализации, а также сравнения распределения в субклеточных фракциях актинина-1, -актинина-4 и р65. Кроме того, обнаружение -актининов и р65 в одних и тех же белковых комплексах не является доказательством их прямого взаимодействия.

Работа была проведена на клетках А431, распластанных на фибронектине, для которых хорошо охарактеризованы структуры актинового цитоскелета и его реорганизация под влиянием эпидермального фактора роста (ЭФР) (Are et al., 2001; Петухова и др., 2004).

Однако до сих пор не было исследовано, каким образом происходит перераспределение р65 в связи с реорганизацией актинового цитоскелета и важны ли актиновые структуры для транслокации р65 в ядро, Цели и задачи работы Цель настоящей работы заключалась в выяснении участия актинового цитоскелета в перераспределении р65 субъединицы NF-B, а также в сравнительной оценке участия актинина-1 и -актинина-4 в событиях, связанных с активацией NF-B.

В работе были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать возможность транслокации р65 в ядро в условиях разрушения актинового цитоскелета после обработки клеток цитохалазином Д (ЦХ Д).

2. Исследовать влияние ЭФР, вызывающего реорганизацию актинового цитоскелета, на распределение р65, F-актина, -актинина-1 и -актинина-4 в цитоплазме и охарактеризовать области их солокализации.

3. Определить совместное присутствие р65, -актинина-1 и -актинина-4 в различных субклеточных фракциях, соответствующих разным компартментам.

4. Исследовать возможность прямого взаимодействия -актининов и NF-B in vitro c использованием метода аффинной хроматографии (GST-pull-down).

5. Исследовать возможность участия -актинина-4 в реакции связывания NF-B с консенсусными последовательностями В.

Основные положения, выносимые на защиту 1. ЭФР стимулирует в клетках А431 два процесса: накопление р65 субъединицы NFB в ядре и перераспределение р65 в цитоплазме. Наблюдается как зависимое от актиновых структур перераспределение, так и независимое.

2. В областях дискретной локализации р65 в цитоплазме, названных пэтчами, обнаруживаются белки, характерные для комплексов, связанных с фокальной адгезией.

3. -Актинин-1 и -актинин-4 демонстрируют как общие, так и специфичные черты в характере распределения.

4. -Актинин способен напрямую взаимодействовать с N-концевой последовательностью р65 субъединицы NF-B in vitro.

5. При добавлении -актинина комплекс р65 субъединицы NF-B с B-специфичной последовательностью ДНК сохраняется.

Научная новизна полученных результатов В работе впервые показано, что в клетках А431 ядерная транслокация р65 под влиянием ЭФР может происходить в клетках с разрушенным актиновым цитоскелетом при отсутствии стресс-фибрилл и раффлов. Описаны дискретные актинсодержащие области локализации р65 субъединицы NF-B в цитоплазме, включающие также белки, характерные для комплексов фокальной адгезии. Продемонстрированы особенности распределения -актинина-1 и -актинина-4 в клетках А431, показана способность непосредственного взаимодействия -актинина с N-концевой последовательностью рсубъединицы NF-B.

Теоретическое и практическое значение работы Результаты имеют фундаментальное значение для понимания роли актинового цитоскелета и актинсвязывающих белков в качестве участников регуляции активности транскрипционных факторов и экспрессии генов. Компоненты актинового цитоскелета, такие как актинсвязывающие белки, могут являться посредниками между транскрипционными факторами и актиновыми структурами. Более того, они могут сопровождать факторы транскрипции в процессе их активации в цитоплазме и участвовать в реализации их функций в ядре. Полученные данные могут быть использованы при проведении лекционно-практических занятий в СПбГУ и СПбГПУ.

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах и 11 тезисов.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2006, 2007), на 11-й и 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007, 2008), на международных конференциях American Society for Cell Biology (Сан Диего, 2006; Вашингтон, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов и на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН. Диссертационная работа апробирована на научном семинаре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН 10 декабря 2008 г.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 174 ссылки. Диссертация изложена на 130 страницах. Иллюстративный материал содержит 7 схем, 25 рисунок и 1 таблицу.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов СПб НЦ РАН (2007 г.), РФФИ (#7852.2006.4), Ведущих научных школ (#07-04-011-90-а), гранта Visby Шведского института (#1361/2006).

Материалы и методы Культивирование клеток А431. Клетки эпидермоидной карциномы линии А431 были получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН.

Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10 % сыворотки эмбрионов о крупного рогатого скота при 37 С в атмосфере 5 % СО2.

Адгезия клеток на фибронектине. Фибронектин в концентрации 10 мкг/мл наносили о на гидрофобные чашки Петри или силиконизированные покровные стекла (ночь, +4 С), затем обрабатывали 2 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. Клетки снимали смесью трипсина и версена в соотношении 3:7. Суспензию клеток в среде ДМЕМ (1.25х106 клеток/мл) наносили на гидрофобные чашки Петри (90 мм) или покровные стекла (1.5х105 клеток/мл), покрытые фибронектином, и инкубировали при 37 С в течение 1 ч в атмосфере 5 % СО2. Клетки на чашках использовали для биохимических исследований, а клетки на стеклах анализировали с помощью иммунофлуоресценции.

ЭФР человека добавляли в концентрации 100 нг/мл, ЦХ Д- в концентрации 2 мкг/мл.

Иммунофлуоресценция. Клетки фиксировали в течение 10 мин 3.7 %-ным раствором параформальдегида, а затем пермеабилизировали 0.1 %-ным раствором Тритона Х-100.

Препараты инкубировали с первыми антителами против р65 субъединицы NF-B, актинина-1, -актинина-4, винкулина или паксиллина и соответствующими вторыми антителами (каждая инкубация по 40 мин) с трехкратной промывкой 0.1 % Tween/PBS после каждой инкубации. Для выявления актинового цитоскелета клетки окрашивали Родамин-фаллоидином в течение 10 мин. Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм для вторых антител Alexa 488; HeNe-лазер с длиной волны 543 нм для Alexa 568 и родамин-фаллоидина. Применяли раздельное сканирование для сигнала Alexa 488 и Alexa 568 (или Родамин-фаллоидина). Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software.

Для анализа присутствия р65 на стресс-фибриллах свободные белки цитоплазмы экстрагировали буферным раствором: 10 мМ PIPES, 5мМ ЭДТА pH 6.8, 300 мМ сахарозы, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0.01 % дигитонина. Мембранные белки экстрагировали буферным раствором: 10 мМ PIPES, 3мМ ЭДТА pH 7.4, 300 мМ сахарозы, 100 мМ NaCl, мМ MgCl2, 0.5 % Тритона Х-100 (Chiang et al., 2000).

Субклеточное фракционирование.

Получение цитоплазматической и ядерной фракций белков. В процессе подбора условий для субклеточного фракционирования использовали следующие буферные растворы: буфер 1: 0.32 М сахарозы, 2 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТА, 0.1 % Тритона Х-100, мM трис-HCl pH 8.0, 1 мM ДТТ, 0.1 мM PMSF, коктейль ингибиторов протеаз; буфер 2:

буфер 1, без Тритона Х-100; буфер 3: буфер 1, содержащий 0.05 % Тритона Х-100. Клетки лизировали в одном из буферных растворов и осаждали ядра при 2000g, 10 мин.

Супернатант содержал цитоплазматическую фракцию. Осадок ядер дополнительно очищали центрифугированием в 0.5 М сахарозе (Марзлав, Хуан, 1987). Ядерные фракции, содержащие транскрипционные факторы (0.4 М NaCl фракция), экстрагировали буфером, содержащим 400 мM NaCl, 20 мM HEPES pH 7.9, 25 % глицерина, 1.5 мM MgCl2, 0.4 мM ЭДТА, 0.4 мM PMSF, 1 мM ДТТ, 2 мM Na3VO4, и центрифугировали при 12000g, 30 мин.

Осадок содержал белки, условно названные “прочно связанные с хроматином”.

Концентрацию белков в ядерных и цитоплазматических экстрактах определяли по методу Бредфорд (Bredford, 1976).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»