WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Применение цитоскелетного буфера на основе PIPES (pH 6.8) дало в целом схожие результаты.

Одной из возможных посттрансляционных модификаций МТ, влияющих на их стабильность, является ацетилирование тубулина (McKean et al., 2001). В контрольных клетках ацетилирование тубулина было выражено слабо – были видны только отдельные короткие ацетилированные участки МТ (рис. 7).

После стимуляции эндоцитоза постепенно происходило ацетилирование участков МТ, приближенных к ЦОМТ. На стадии восстановления радиальной сети МТ их ацетилированнность значительно увеличивалось, и протяженные ацетилированные участки МТ оказывались распределенными по всей длине МТ. Таким образом, восстановленная радиальная структура тубулинового цитоскелета отличается от исходной устойчивостью к экстракции и усилением ацетилирования.

Зависимость реорганизации сети МТ от других типов цитоскелета (Kornilova et al., 2008). Наши данные позволяют предположить, что фрагменты МТ могут стабилизироваться в околоядерной зоне, возможно, за счет взаимодействия с другими элементами цитоскелета. Поэтому мы попытались выяснить, существенны ли микрофиламенты и промежуточные виментиновые филаменты для вышеописанной реорганизации МТ. В условиях коллапса актиновых структур под действием цитохалазина D реорганизация системы МТ в ходе эндоцитоза протекала без нарушений. Можно заключить, Рис. 7. Ацетилирование тубулина при реорганизации системы МТ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в клетках HeLa.

что изменения тубулинового цитоскелета не связаны с реорганизацией актиновой сети.

Для проверки влияния промежуточных филаментов на перестройку сети МТ были использованы клетки мыши и MFT-6, лишенные гена виментина, и клетки MFT-16 с восстановленной экспрессией виментина. В клетках обеих линий до стимуляции эндоцитоза мы наблюдали спутанную сеть МТ (рис. 8). В клетках MFT-16 эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов приводит к фрагментации МТ, в некоторых клетках наблюдается частичная деполимеризация (30-90 мин). Подобных изменений в клетках, лишенных виментина, не происходит. Таким образом, можно предположить непосредственное участие виментина в реорганизации системы МТ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

Рис. 8. Изменение организации тубулинового цитоскелета зависит от промежуточных филаментов (виментина).

Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках, экспрессирующих мутантные формы рецептора ЭФР (Корнилова и др., 2005). Чтобы подойти к ответу на вопрос о том, какие сигналы инициируют преобразования, мы использовали клеточные линии, полученные на основе фибробластов мыши NIH 3Т3, экспрессирующие нормальную и мутантные формы рецептора ЭФР человека. Эти формы лишены С-терминальных доменов разной длины, несущих сайты связывания с сигнальными субстратами рецептора (СD165, СD123, CD63). Одной из особенностей этих клеток является разная динамика эндоцитоза (Корнилова и др., 2005). Так, лиганд-рецепторные комплексы в клетках CD165 не попадают в поздние эндосомы, а в основном рециклируют из ранних. В клетках СD123 комплексы сортируются в поздние эндосомы с низкой эффективностью, а CD63 с эффективностью, присущей нормальному рецептору (HER14) (рис. 9 Б). В клетках линий HER14, CD63 и CD123 эндоцитоз рецептора ЭФР приводит к описанной выше фрагментации МТ (15 мин), а потом и к деполимеризации тубулина (60 мин). В то же время, радиальная система МТ в клетках CDсохраняется в ходе всего эксперимента и не подвергается никаким изменениям. Таким образом, способность рецептора ЭФР к переходу в поздние эндосомы может быть критичной для инициации перестроек тубулинового цитоскелета.

Рис. 9. Стимуляция эндоцитоза рецептора ЭФР в фибробластах мыши, экспрессирующих нормальную (HER 14) или мутантные формы рецептора ЭФР человека (DC63, DC123, и DC165). Выявление тубулина в клетках методом иммунофлуоресценции (А); компартментализация 125I-ЭФР ходе эндоцитоза (Б): по оси абсцисс – количество 125I-ЭФР во фракции, %; по оси ординат – номер фракции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Приведенные результаты позволяют предположить, что для начала реорганизации радиальной системы МТ необходимо достижение рецепторсодержащими эндосомами определенной стадии зрелости, по-видимому, соответствующей переходу в поздние эндосомы. Для созревания поздних эндосом необходимо участие определенных сортирующих комплексов, компоненты которых могут взаимодействовать с белками, дестабилизирующими МТ (Tsang et al., 2006). Например, есть сообщения о том, что компонент ESCRTI-комплекса, TSG101, способен взаимодействовать со статмином. Статмин привлекает наше внимание также и потому, что по крайней мере два сигнальных каскада способны изменять активность статмина - МАР-киназный каскад приводит к фосфорилированию статмина, а STATобразует комплексы со статмином в неактивированном состоянии. Кроме того, статмин не является единственным кандидатом, список белков, способных взаимодействовать как с эндосомами, так и с МТ, постоянно растет. Поэтому, хотя из общих соображений, а также из данных, полученных на мутантах, было бы разумно предположить, что такие модификации МТ должны стимулироваться при достижении эндосомами, нагруженными любым грузом, направляемым на лизосомную деградацию, определенной степени «зрелости», нельзя исключать вероятность того, что и передача сигнала с рецептора участвует в регуляции реорганизаций МТ. Аналогично, сигналом к восстановлению системы тубулинового цитоскелета может служить слияние поздних МВЭ с лизосомами или отсоединение вторичных МВЭ.

Характерно, что радиальная сеть МТ присутствует именно на тех стадиях эндоцитоза, которые нуждаются в радиальном перемещении везикул.

Действительно, на ранних этапах эндоцитоза необходимо переместить ранние эндосомы в околоядерную область. Передвижение везикул на стадиях формирования МВЭ и существования гибридной эндо-лизосомы не нужно.

Вторичные МВЭ после отделения от лизосом, по-видимому, выводятся из клеток экзоцитозом с участием МТ. Действительно, появление продуктов деградации ЭФР имеет место при восстановлении радиальных МТ. Косвенно это подтверждается тем, что количество ацетилированного тубулина, предпочтительно взаимодействующего с кинезинами (Reed et al., 2006), значительно возрастает, когда деградация ЭФР-рецепторных комплексов достигает максимальной скорости. Тем не менее, реальная картина может быть гораздо сложнее схем, рассматривающих только транспортную функцию МТ.

Например, при фрагментации и деполимеризации МТ могут высвобождаться сигнальные молекулы, депонированные на МТ. Таким образом, МТ, как и цитоскелет в целом, могут играть роль интегратора транспортных и сигнальных процессов.

ВЫВОДЫ 1. Радиальная система МТ в культивируемых интерфазных клетках подвергается последовательным реорганизациям при стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов. Стадия перехода лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы сопровождается видимой «фрагментацией» и (или) деполимеризацией МТ, в то время как выход продуктов деградации ЭФР во внеклеточную среду коррелирует с восстановлением радиальности сети МТ.

2. Длительность, характер и степень проявления отдельных этапов реорганизации МТ связана с динамикой эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

3. Радиальные МТ, поддерживающие перенос ранних эндосом в околоядерную область, отличаются от «фрагментированых» и радиальных МТ, наблюдаемых на более поздних этапах эндоцитоза, по чувствительности к обработке цитоскелетным буфером и по ацетилированности.

4. Реализация стадии «фрагментации» МТ нуждается в присутствии промежуточных (виментиновых) микрофиламентов, но не зависит от интактности актинового цитоскелета.

5. В клетках, экспрессирующих мутантную форму рецептора ЭФР, не способную к переходу в поздние эндосомы, перестроек тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза не наблюдается. Можно предполагать, что для начала изменений тубулинового цитоскелета необходимо достижение эндосомами определенной степени зрелости, т.е. их ассоциация с определенными белковыми комплексами.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Железнова Н.Н., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С.

2003. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ p85/p110 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФРрецепторных комплексов. Цитология. 45 (6): 574-2. Харченко М.В., Корнилова Е.С., Меликова М.С. 2007. Изменение организации системы микротрубочек в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР. Цитология. 49 (3): 236-3. Kharchenko M.V., Aksyonov A. A., Melikova M.M., Kornilova E.S. 2007. Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells. Cell Biol. Int. 31: 349-359.

5. Корнилова Е.С., Харченко М.В., Авров К.О. 2005. Роль эндоцитоза в регуляции сигналов, стимулируемых рецепторами эпидермального фактора роста. Тезисы Международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”: 12-13.

6. Харченко М.В., Аксенов А.А., Шрамко Б.В., Корнилова Е.С. 2006. Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в культивируемых клетках. Цитология. 48: 808.

7. Харченко М.В., Злобина М.В., Шрамко Б.В., Корнилова Е.С. 2007. Характер реорганизации радиальной системы микротрубочек в клетках HeLa с различной динамикой эндоцитоза. Цитология. 49 (9): 803.

8. Kornilova E.S., Zlobina M.S., Kharchenko M.V. 2008. Interphase microtubules undergo reorganizations at late stages of EGF receptor degradative pathway. Abstracts of 33rd FEBS Congress: 253.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Авров К.О., Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1996.

Зависимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня активности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 38(10):

1084-1091.

Железнова Н.Н., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С.

2003. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ p85/p110 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФРрецепторных комплексов. Цитология. 45: 574-581.

Корнилова Е.С., Харченко М.В., Авров К.О. 2005. Роль эндоцитоза в регуляции сигналов, стимулируемых рецепторами эпидермального фактора роста. Тезисы Международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”: 12-13.

Смурова К.М., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 2007. Свободные и связанные с центросомой микротрубочки: количественный анализ и моделирование двухкомпонентной системы.

Цитология. 49: 270-279.

Соколова И.П., Арнаутов А.М., Благовещенская А.Д., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 1998. Влияние нокодазола на эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста.

Цитология. 40: 855-681.

Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. 1993. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol. 123: 1373.

D'Arrigo A., Bucci C., Toh B.H,, Stenmark H. 1997. Microtubules are involved in bafilomycin A1-induced tubulation and Rab5-dependent vacuolation of early endosomes. Eur J Cell Biol.

72(2): 95-103.

Diaz E., Pfeffer S.R. 1998. TIP47: a cargo selection device for mannose 6-phosphate receptor trafficking. Cell. 93(3): 433-443.

Folker E., Baker B., and Goodson H. 2005. Interaction of the Microtubule Cytoskeleton with Endocytic Vesicles and Cytoplasmic Dynein in Cultured Rat Hepatocytes. J. Biol. Chem. 270:

15242.

Harrison R., Bucci C., Vieira O., Schroer T., Grinstein S. 2003. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23: 6494-6506.

Kharchenko M.V., Aksyonov A. A., Melikova M.M., Kornilova E.S. 2007. Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells. Cell Biol. Int. 31: 349-359.

Kornilova E.S., Zlobina M.S., Kharchenko M.V. 2008. Interphase microtubules undergo reorganizations at late stages of EGF receptor degradative pathway. Abstracts of 33rd FEBS Congress: 253.

McKean P.G., Vaughan S., and Gul K. 2001. The extended tubulin superfamily. J. Cell Sci.

114: 2723-2733.

Melikova M.S., Kondratov K.A., and Kornilova E.S. 2006. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG132. Cell Biol. Int. 30(1): 31-43.

Oda H., Stockert R.J., Collins C., Wang H., Novikoff P.M., Satir P., Wolkoff A.W. 1995.

Interaction of the Microtubule Cytoskeleton with Endocytic Vesicles and Cytoplasmic Dynein in Cultured Rat Hepatocytes. J. Biol. Chem. 270: 15242.

Reed N.A., Cai D., Blasius T.L., Jih G.T., Meyhofer E., Gaertig J., Verhey K.J. 2006.

Microtubule acetylation promotes kinesin-1 binding and transport. Curr Biol. 16(21): 2166-2172.

Tsang H.T., Connell J.W., Brown S.E., Thompson A., Reid E., Sanderson C.M. 2006. A systematic analysis of human CHMP protein interactions: additional MIT domain-containing proteins bind to multiple components of the human ESCRT III complex. Genomics. 88: 333 346.Valetti C., Wetzel D.M., Schrader M., Hasbani M.J., Gill S.R., Kreis T.E., Schroer T.A.

1999. Role of Dynactin in Endocytic Traffic: Effects of Dynamitin Overexpression and Colocalization with CLIP-170. Mol. Cell. Biol. 23: 6494-6506.

Van Deurs B., Holm P.K., Kayser L., Sandvig K. 1995. Delivery to lysosomes in the human carcinoma cell line Hep-2 involves an actin filament-facilitated fusion between mature endosomes and preexisting lysosomes. Eur. J. Cell Biol. 66: 309-323.

Xie J., Quan L., Wang Y., Hamma-Alvares S.F., Mircheff A.K. 2004. Role of the microtubule cytoskeleton in traffic of EGF through the lacrimal acinar cell endomembrane network. Exp Eye Res. 78(6): 1093-1106.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»