WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Распределение флуоресцентно-меченных белков в клетках изучали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL (Zeiss, Германия). Зеленую флуоресценцию возбуждали аргоновым лазером (488 нм), красную – He-Ne лазером (543 нм). Флуоресценцию на разных длинах волн сканировали раздельно с помощью программы Leica Confocal Software. Анализ изображений выполняли с помощью программы ImageJ 1.40g (National Institute of Health, Maryland, USA). На черно-белых рисунках приведено инвертированное изображение.

Измерение интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, в цитоплазме клеток. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью программы ImageJ 1.40g. Была использована методика, разработанная для оценки соотношения свободных и связанных с ЦОМТ МТ (Смурова и др., 2007). Исследуемую область клетки от ЦОМТ до ее периферии разделили на 10 равных отрезков, на каждом из которых определяли среднюю интенсивность флуоресценции с 95 %-ным доверительным интервалом. Измерения проведены для 5 клеток каждого типа.

Воспроизводимость экспериментов. Все эксперименты проводили не менее 3 раз.

Для анализа выбирали клетки с максимальной степенью распластывания, на краю или вне островков монослоя. Для каждой временной точки просматривалось по крайней мере по три поля (около 20-30 клеток) на двух разных стеклах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФРрецепторных комплексов (Железнова и др., 2003; Харченко и др., 2007;

Kharchenko et al., 2007; Kornilova et al., 2008). Для исследования эндоцитоза, опосредованного рецепторами, используют два подхода: импульсную загрузку и предварительное связывание лиганда. При импульсной загрузке лиганд С добавляли к клеткам при температуре 37 и удаляли через определенное время. Такая постановка эксперимента приближена к физиологическим условиям, однако, процессы связывания лиганда с рецепторами, интернализация и переход в поздние эндосомы лиганд-рецепторных комплексов перекрываются во времени. Альтернативно используется схема предварительного связывания: при 4 С лиганд связывается с рецептором на поверхности клетки, но лиганд-рецепторные комплексы не подвергаются С интернализации. Дальнейшее нагревание клеток до 37 стимулирует синхронную волну транспортных событий. Недостатком метода является необходимость охлаждения клеток, приводящего к деполимеризации структур цитоскелета во многих типах клеток. Мы исследовали эндоцитоз ЭФРрецепторных комплексов и реорганизацию тубулинового цитоскелета в клетках HeLa с помощью методов двойной непрямой иммунофлуоресценции и параллельного субклеточного фракционирования в градиенте плотности Перколла, используя обе схемы стимуляции клеток, для того чтобы установить их применимость и адекватность.

При использовании метода импульсной загрузки I-ЭФР выявлялся в везикулах с большим разбросом по плавучей плотности, от очень низкого до максимального, характерного для лизосом (рис. 1 А). Наибольшее количество радиоактивной метки приходилось на чуть более тяжелые везикулы, чем в Рис. 1. Компартментализация (А) и деградация (Б) 125I-ЭФР в ходе эндоцитоза при использовании методик предварительного связывания и импульсной загрузки лиганда. Отмечены фракции лизосом (Лиз), поздних и ранних эндосом (ПЭ и РЭ).

случае предварительного связывания, для той же временной точки. Общее количество интернализованного I-ЭФР также было выше при импульсной загрузке лиганда. В этом случае также наблюдался более быстрый выход радиоактивной метки во внеклеточную среду, что свидетельствует о более высокой скорости деградации I-ЭФР в лизосомах, чем в случае предварительного связывания лиганда (рис. 1 Б). Мы объясняем эти различия синхронным, но относительно медленным из-за постепенного нагревания протеканием стадий эндоцитоза в случае предварительного связывания лиганда. Методом иммунофлуоресценции также было показано, что при импульсной загрузке лиганда содержание рецептора ЭФР во внутриклеточных пузырьках было больше, и перераспределение везикул в околоядерную область происходило быстрее, чем при предварительном связывании лиганда (рис. 2, 3).

При анализе реорганизации тубулинового цитоскелета с использованием схемы импульсной загрузки (рис. 2) мы выявили следующие изменения. До добавления ЭФР сеть МТ была радиальной. Через 30 мин после стимуляции эндоцитоза, одновременно с перераспределением везикул, содержащих рецептор ЭФР, в область ЦОМТ, существенно увеличивалась интенсивность окрашивания тубулина в околоядерной области, а на периферии клетки появлялись спутанные МТ. Через 90 мин после стимуляции эндоцитоза тубулиновый цитоскелет переходит в изначальное состояние (радиальная сеть МТ максимально сконцентрирована вокруг ЦОМТ и занимает всю периферию клетки). Это совпадало по времени с уменьшением интенсивности окрашивания околоядерных структур, содержащих рецептор ЭФР, что свидетельствует о начале деградации рецептора.

Более четкие изменения тубулинового цитоскелета наблюдались при стимуляции эндоцитоза рецептора ЭФР по схеме предварительного С связывания (рис. 3). После инкубации клеток при 4 происходила разборка МТ. Через 15 мин после стимуляции эндоцитоза восстанавливалась радиальная сеть МТ. В это время мелкие везикулы, содержащие рецептор ЭФР, детектировались на периферии клеток. Затем параллельно с увеличением размера эндосом и перемещением их к центру клетки (30 и 60 мин) число длинных радиальных МТ уменьшалось, а интенсивность окрашивания тубулина вокруг ЦОМТ усиливалась. В целом система приобретала «губкоподобный» вид (спутанная сеть МТ), отдельные МТ укорачивались, возможно, фрагментировались и даже частично деполимеризовались.

Разрешение метода иммунофлуоресценции не позволяет нам утверждать, что имеет место истинная фрагментация. Возможно, что наблюдаемая спутанная сеть вызвана изменением связывания специфических антител с тубулином изза экранирования МТ какими-то белками. В результате этого длинная МТ может выглядеть как набор фрагментов. При этом очевидно, что сеть МТ утрачивает радиальность и что появляются отдельные сильно изогнутые МТ.

Рис. 2. Выявление рецептора ЭФР и тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках HeLa. Эндоцитоз ЭФР стимулировали по схеме импульсной загрузки лиганда.

Рис. 3. Выявление рецептора ЭФР и тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках HeLa. Эндоцитоз ЭФР стимулировали по схеме предварительного связывания лиганда.

Наибольшие изменения претерпевали МТ именно в той области, в которой концентрировались эндосомы. Стадия дезорганизации радиальной системы совпадала с переходом ЭФР-рецепторных комплексов в поздние эндосомы по данным субклеточного фракционирования. В дальнейшем радиальная система МТ восстанавливалась. Эта стадия совпадала по времени с уменьшением окрашивания везикул антителами к рецептору ЭФР и появлением продуктов деградации I-ЭФР в среде, то есть со стадией лизосомальной деградации ЭФР и рецептора ЭФР. Степень «фрагментации» и деполимеризации различалась от эксперимента к эксперименту: внешний вид тубулинового цитоскелета варьировал от «губкоподобного» до почти деполимеризованного, с несколькими длинными и изогнутыми МТ.

Наши данные свидетельствуют о том, что методика предварительного связывания рецептора с ЭФР принципиально не изменяет путь лигандрецепторных комплексов в клетке, но, в то же время, синхронизирует и несколько замедляет прохождение этих молекул через компартменты клетки, по сравнению с импульсной загрузкой лиганда. Реорганизация тубулинового цитоскелета также происходит при использовании любой из методик, хотя в случае предварительного связывания она более выражена и при этом замедлена. Также мы доказали, что изменения тубулинового цитоскелета не вызваны нагреванием клеток после охлаждения при предварительном связывании лиганда: уже через 5 мин после перевода клеток в среду о температурой 37 С в отсутствие ЭФР система МТ восстанавливалась и сохраняла радиальность по крайней мере несколько часов (данные не представлены). Таким образом, методика предварительного связывания дает более четкую картину и физиологически значимые данные. Все дальнейшие результаты получены с применением схемы предварительного связывания лиганда.

Описанная нами реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза наблюдалась не только в клетках HeLa, но и во многих других эпителиальных и фибробластоподобных клеточных линиях (А431, SKBR-3, PAE A II, HEK 293, NIH 3T3, Her 14). Кроме того, схожие изменения тубулинового цитоскелета были обнаружены при стимуляции эндоцитоза фактором роста тромбоцитов (PDGF), хотя их скорость обычно была выше, чем в случае ЭФР (данные не представлены). Таким образом, наблюдаемый феномен в большей степени связан со стадиями эндоцитоза, чем с определенной линией клеток или определенным лигандом.

Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках с разной скоростью эндоцитоза (Kharchenko et al., 2007). Ранее было показано (Авров и др., 1996; Melikova et al., 2006), что в различных экспериментах клетки отличаются по скорости интернализации, сортировки лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы, рециклирования и деградации.

Перечисленные параметры могут варьировать в широких пределах даже в клетках одной и той же линии в зависимости от внешних условий. Можно выделить два крайних варианта эндоцитоза – «медленный» и «быстрый».

Выше были приведены данные для клеток с быстрым эндоцитозом, с эффективной лизосомной деградацией рецептора (рис. 3). Для быстрого эндоцитоза характерна смена стадии радиальности сети МТ на стадию дезорганизации или фрагментирования с последующим восстановлением радиальности. В клетках с медленным эндоцитозом, в которых сортировка рецептора в поздние эндосомы и его деградация оказывались неэффективными, транспорт эндосом в околоядерную область уменьшался вплоть до полного прекращения. При такой динамике эндоцитоза изначальные радиальные МТ в незначительной степени фрагментировались, а затем полностью деполимеризовались (рис. 4). Даже через 150 мин после начала стимуляции эндоцитоза радиальная сеть МТ не восстанавливалась. При этом эндосомы не увеличивались в размере, что свидетельствует о подавлении процесса их созревания.

Мы можем заключить, что при стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов стадия перехода лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы сопровождается «спутыванием», «фрагментацией» и (или) деполимеризацией МТ, в то время как деградация ЭФР коррелирует с восстановлением радиальности. Эта корреляция со стадиями эндоцитозного пути справедлива для обоих методов стимуляции клеток и для обоих типов эндоцитоза, несмотря на различие временных параметров. Результаты свидетельствуют о том, что вся последовательность реорганизаций системы МТ не запрограммирована изначально на ранней стадии эндоцитоза. Мы предполагаем, что сигналы на реорганизацию сети МТ и на ее восстановление формируются на разных стадиях эндоцитоза, с различающихся по степени «зрелости» эндосом.

Чувствительность МТ к экстракции и степень ацетилирования тубулина изменяются в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов (Kharchenko et al., 2007). Соотношение свободных и ассоциированных с ЦОМТ МТ одна из важных характеристик тубулинового цитоскелета.

Существует подход для оценки этого параметра по скорости падения интенсивности флуоресценции тубулина от центра к периферии клетки она выше для клеток с преобладанием МТ, связанных с ЦОМТ (Смурова и др., 2007). Применение этой модели к нашим данным показало, что клетки с радиальной организацией тубулинового цитоскелета различаются по соотношению свободных и связанных с ЦОМТ МТ, при этом преобладают МТ, связанные с ЦОМТ (рис. 5 А, Б). В клетках с деполимеризованным тубулином интенсивность флуоресценции слабо меняется от центра к периферии клетки (рис. 5 Г, Д). Наибольший интерес представляет описание «губкоподобной» организации тубулинового цитоскелета (рис. 5 В). В большинстве таких клеток хорошо выявляется ЦОМТ. Падение интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, от ЦОМТ к периферии таких клеток, близкое к Рис. 4. Совместное выявление рецептора ЭФР (отдельные везикулы указаны стрелкой) и тубулина в клетках HeLa с разной скоростью эндоцитоза.

Рис. 5. Изменения интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, от ЦОМТ к периферии клеток с разной организацией МТ цитоскелета (А, Б – радиальная сеть МТ; В - губкоподобная сеть; Г, Д – деполимеризация тубулина, полная и частичная, соответственно).

линейному, соответствует предположению о преобладании «свободных» МТ разной длины. По причине большого разброса между отдельными клетками точно оценить параметры зависимостей между интенсивностью флуоресценции и расстоянием от ЦОМТ не представляется возможным.

Для оценки доли деполимеризованного тубулина и незакрепленных фрагментов МТ в клетках на разных стадиях эндоцитоза мы использовали раствор для экстракции растворимых цитоплазматических белков, далее Рис. 6. Выявление тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках HeLa до и после обработки клеток цитоскелетным буфером (ЦБ) HEPES (рН 7,2).

А – клетки с быстрой сортировкой лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы. Б – клетки с медленной интернализацией называемый цитоскелетным буфером. Такая методика позволяет удалить из клетки все молекулы, растворенные в цитоплазме, в том числе димеры тубулина. Мы ожидали разделить полимеризованный и деполимеризованный тубулин, однако использование цитоскелетного буфера (на основе HEPES рН 7.2) дало парадоксальные результаты. Радиальные МТ в контрольных клетках практически полностью вымывались, в них оставались единичные искривленные МТ разной длины (рис. 6). Когда же в необработанных буфером клетках МТ приобретали наиболее спутанный, фрагментированный вид («губкоподобная» организации тубулинового цитоскелета), обработка клеток цитоскелетным буфером практически не изменяла морфологию МТ цитоскелета. На рис. 6 А представлен случай эндоцитоза с быстрой сортировкой в поздние эндосомы. В клетках с медленной интернализацией максимальная дезорганизация МТ наблюдается через 60 мин после стимуляции эндоцитоза. Радиальные МТ, существовавшие в клетках до этой стадии, также чувствительны к действию буфера, тогда как фрагментированные дезорганизованные МТ – нет (рис. 6 Б). Таким образом, «фрагментированная», дезорганизованная сеть МТ отличается устойчивостью к действию цитоскелетного буфера вне зависимости от времени ее возникновения.

Радиальная сеть МТ, восстановившаяся на стадии деградации рецептора ЭФР, оказалась устойчивой к экстракции цитоскелетным буфером. Эти данные позволяют предположить, что свойства МТ в ходе эндоцитоза изменяются.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»