WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ХАРЧЕНКО Марианна Викторовна РЕОРГАНИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ МИКРОТРУБОЧЕК В ХОДЕ ЭНДОЦИТОЗА ЭФР-РЕЦЕПТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008 2

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, Корнилова Елена Сергеевна, Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Пинаев Георгий Петрович, Институт цитологии РАН кандидат биологических наук Сабанеева Елена Валентиновна, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ

Защита состоится 19 декабря 2008 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Электронный адрес: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан ноября 2008 г.

Ученый секретарь Е.В. Каминская диссертационного совета кандидат биологических наук 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Эндоцитоз – один из видов везикулярного транспорта, присущего всем эукариотам. В случае эндоцитоза, опосредованного рецептором, лиганд взаимодействует со своим рецептором, находящимся на плазматической мембране, и образовавшийся лиганд-рецепторный комплекс поступает внутрь клетки (интернализуется). Затем комплексы либо рециклируют на плазматическую мембрану, либо деградируют в лизосомах. Лигандрецепторные комплексы, направляемые на деградацию, переходят в поздние мультивезикулярные эндосомы (МВЭ), локализованные в околоядерной области. В этой части клетки зрелые МВЭ взаимодействуют с лизосомами.

Считается, что такие перемещения происходят с участием компонентов цитоскелета, в том числе, микротрубочек (МТ). Это предположение получило в дальнейшем множество подтверждений, был идентифицирован ряд белков, обеспечивающих взаимодействие эндосом с плюс-концами МТ и движение везикул в сторону центра организации МТ (ЦОМТ), – таких как СLIP170, динеин/динактиновый комплекс, Rab-белки и др. (Folker et al., 2005; Oda et al., 1995; Valetti et al., 1999; Harrison et al., 2003). Перемещения эндосом с периферии клетки в околоядерную область не происходит при обработке клеток агентами, разрушающими МТ (van Deurs et al., 1985; Соколова и др., 1998; Xie et al., 2004). Данные различных исследователей о роли МТ в эндоцитозе чрезвычайно противоречивы. Сообщается, например, о замедлении разных стадий эндоцитоза – от сортировки молекул из ранних эндосом в поздние до взаимодействия поздних эндосом с лизосомами после разрушения МТ деполимеризующими агентами (Aniento et al., 1993; D’Arrigo et al., 1997;

Xie et al., 2004). В других работах эта точка зрения ставится под сомнение (Diaz et al., 1991; van Deurs et al., 1995; Соколова и др., 1998).

Клетки, экспрессирующие рецепторы эпидермального фактора роста (ЭФР), широко используются для изучения эндоцитоза, передачи внутриклеточного сигнала, а также взаимосвязи этих двух процессов. За последние два десятилетия были идентифицированы многие белки (такие, как адаптерный белок Eps15, убиквитин-лигаза с-Cbl, малые ГТФазы Rab5 и Rab7, фосфатидилинозитол-3-киназы и др.), участвующие в регуляции эндоцитоза на разных этапах, выяснены некоторые механизмы сортировки. Однако морфология тубулинового цитоскелета после стимуляции эндоцитоза до сих пор не изучалась. В ходе наших исследований роли фосфатидилинозитол-3киназ 1-го класса в регуляции эндоцитоза было доказано, что они ассоциируются с некими внутриклеточными структурами, отличными от эндосом (Железнова и др., 2003). Эти структуры находятся в области ЦОМТ и совпадают с МТ. В дальнейшем мы впервые описали перестройки тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза, связанные с нарушением радиального расположения МТ.

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы выявить основные закономерности перестройки тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР.

Задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. описать изменения системы МТ, происходящие после стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, в культивируемых интерфазных клетках;

2. выявить взаимосвязь характера реорганизации тубулинового цитоскелета от скорости эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;

3. выяснить, различаются ли МТ на разных стадиях реорганизации по свойствам;

4. оценить участие других типов цитоскелета – актиновых и промежуточных филаментов – в реорганизации микротрубочек в ходе эндоцитоза;

5. выяснить специфичность изменения тубулинового цитоскелета по отношению к различным лигандам и клеточным линиям.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Радиальная система МТ после стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в клетках подвергается последовательным реорганизациям, включающим видимую «фрагментацию» и (или) деполимеризацию МТ и последующее восстановление радиальности.

2. Длительность, характер и степень проявления отдельных этапов реорганизации МТ коррелируют с динамикой эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов. Реорганизация МТ не наблюдается в клетках, в которых рецептор ЭФР не переходит в поздние эндосомы.

3. Радиальные МТ, присутствующие в клетке до начала эндоцитоза, отличаются от «фрагментированых» и радиальных МТ, наблюдаемых на более поздних этапах эндоцитоза, по чувствительности к обработке цитоскелетным буфером и по ацетилированности.

4. Реализация стадии «фрагментации» МТ нуждается в присутствии промежуточных (виментиновых) микрофиламентов, но не зависит от интактности актинового цитоскелета.

Научная новизна работы Впервые показано, что радиальная система МТ претерпевает последовательные изменения в ходе эндоцитоза. Описанный феномен характерен для широкого ряда культивируемых клеточных линий эпителия и фибробластов. Впервые выявлена связь между стадиями эндоцитоза и архитектурой тубулинового цитоскелета. Впервые продемонстрировано, что радиально расположенные МТ на ранних и на поздних стадиях эндоцитоза отличаются по свойствам.

Теоретическое и практическое значение работы Работа имеет фундаментальную направленность. Наши данные позволяют выдвинуть гипотезу о координирующей и интегрирующей роли МТ в ходе эндоцитоза, опосредованного рецепторами ЭФР. Эта гипотеза составляет альтернативу общепринятым представлениям о МТ как о пассивных «рельсах» для перемещения везикул. Теоретические результаты могут быть использованы в курсах лекций по цитологии и молекулярной биологии.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликованы 8 печатных работ (в том числе, статьи). Основные положения были доложены и обсуждались на на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на II съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), на 33-й конференции FEBS (Афины, 2008) и на научных семинарах Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и списка цитируемой литературы, включающего 212 источников. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста и иллюстрирована 21 рисунком.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Культивирование клеточных линий. В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431 и линии HeLa, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, СанктПетербург) и Европейской коллекции клеточных культур, соответственно. Клетки эпителия молочной железы линии SKBR3 любезно предоставлены проф. С.М.

Деевым (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.A. Овчинникова).

Клетки эмбриональной почки человека HEK 293 любезно предоставлены П.С.

Грудинкиным (Каролинский университет, Швеция). Клетки, экспрессирующие нормальную или мутантные формы рецептора ЭФР человека (HER14, DC165, DC123, DC63), независимо полученные на основе фибробластов мыши линии NIH 3Т3, были любезно предоставлены Дж. Шлессинджером (Нью-Йоркский университет, США).

Клетки эндотелия аорты (PAE А II), трансфицированные плазмидой, кодирующей рецептор ЭФР, слитый с зеленым флуоресцирующим белком, получены от А.Д. Соркина (Университет Колорадо, США).

Все клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 7-10 % С фетальной сыворотки (РАА, Австрия) при 37 в атмосфере с 5 % СО2. Клетки выращивали до 50-70 % монослоя. За 12 ч до опыта клетки переводили на среду, содержащую 0,25 % фетальной сыворотки.

Лиганды и их производные. В работе были использованы рекомбинантный ЭФР (Sigma) и ЭФР, выделенный из подчелюстных желез мыши (Никольский и др., 1985), в концентрации 50 нг/мл, рекомбинантный фактор роста тромбоцитов ВВ (PDGF) (Oncogene, Германия) в концентрации 20 нг/мл. Иодирование ЭФР проводили по модифицированному методу Вайли и Каннингама (Wiley, Cunningham, 1982) c использованием иодогена (1,3,4,6-тетрахлор-3,6-дифенилглюкоурила) и Na125I.

Специфическая активность полученного препарата составляла 200-400 тысяч имп./мин на 1 нг ЭФР.

Антитела. Для специфического выявления рецептора ЭФР использовали поликлональные антитела кролика, узнающие экстраклеточный домен рецептора ЭФР человека (любезно предоставлены Д.Б. Твороговым, Университет Вандербильда, США), в разведении 1:500. Моноклональные мышиные антитела против -тубулина (Sigma) использовали в разведении 1:2000, а против ацетилированного тубулина (Sigma) – в разведении 1:1000. В качестве вторых антител использовали конъюгаты GAR-Alexa Fluor 568 и GAM-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Англия) в разведении 1:500. Антитела разводили фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4), содержащим 1 % БСА.

Обработка клеток цитохалазином D. Клетки инкубировали в течение 60 мин при 37 С в рабочей среде, содержащей 10 мкМ цитохалазин D (Sigma). Все дальнейшие инкубации проводили в постоянном присутствии цитохалазина в рабочей среде.

Обработка клеток буфером для экстракции растворимых цитоплазматических белков (цитоскелетным буфером). После завершения стимуляции эндоцитоза клетки дважды промывали PBS и инкубировали 1 мин при комнатной температуре в цитоскелетном буфере. Затем клетки дважды промывали PBS и фиксировали 4 %-ным раствором формалина (Sigma) в PBS. Цитоскелетный буфер содержал 20 мМ HEPES (рН 7,2) или 10 мМ PIPES (рН 6,8), 3 мМ MgCl, 50 мМ NaCl, 10 % глицерин, 0,1 % Triton-X100, 1 мМ Na3V04, 1 мМ NaF и коктейль протеазных ингибиторов (Invitrogen,США).

Исследование динамики эндоцитоза проводили по схеме предварительного связывания и по схеме импульсной загрузки лиганда.

Предварительное связывание. Для связывания лиганда с рецепторами клетки инкубировали в рабочей среде Игла, содержащей 0,1 % БСА и 20 мМ HEPES (pH 7,4) при С в течение 60 мин в присутствии лиганда. После 5-кратной отмывки PBS от несвязавшегося лиганда эндоцитоз стимулировали переводом клеток в среду, не содержащую лиганд, нагретую до 37 С, на указанное время.

Импульсная загрузка лиганда. Для связывания лиганда с рецепторами монослойные культуры клеток инкубировали в рабочей среде Игла, содержащей 0,1 % БСА и 20 мМ С HEPES (pH 7,4) при 37 в течение 15 мин в присутствие лиганда. После 5-кратной С), отмывки теплой средой (20 клетки переводили в рабочую среду, не содержащую лиганда (при 37 С), на указанное время с учетом 15-минутной инкубации.

Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17 %-ного Перколла позволяет разделить внутриклеточный пул везикул на три основные фракции - ранних эндосом (1,04 г/мл, 8-12-я фракция), поздних эндосом (1,05 г/мл, 3-6-я фракция) и лизосом (1,07 г/мл, 1-4-я фракция). Для изучения распределения эндоцитированного ЭФР внутри клеток мы собирали клетки в буфер ТЭС (10 мМ триэтаноламина, 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, рН 6,8) и после осаждения ядер и неразбитых клеток надосадок смешивали с Перколлом, конечная концентрация которого составляла 17 %. Градиент формировали мин при 50000 g на центрифуге Spinko L2-65K с угловым ротором 65 (Beckman).

Фракционирование градиента на 17 фракций проводили со дна пробирки через иглу.

Измерение радиоактивности проб осуществляли на гамма-счетчике Mini-Gamma (LKB).

Количественную оценку радиоактивности интернализованного и деградированного лигандов проводили по программе «Градиент». Результаты выражали в относительных единицах, полученных путем приведения радиоактивности каждой фракции к общей радиоактивности, первоначально связанной клетками.

Определение степени деградации лиганда. Количество деградированного лиганда определяли методом осаждения высокомолекулярных пептидов раствором, содержащим 5 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 1 % фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК). Для этого после окончания инкубационного периода среду сливали и смешивали с раствором ТХУ/ФВК в объемном соотношении 1:6. Через 2 ч инкубации при 4 С смесь подвергали центрифугированию при 6000 об./мин на центрифуге К23, осадок промывали аналогичным образом 2 раза, надосадочную жидкость собирали и по содержащейся в нем радиоактивности оценивали количество деградированного лиганда.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток. После окончания инкубации клетки дважды промывали PBS, а затем фиксировали 4 %-ным раствором формалина (Sigma) на PBS при комнатной температуре в течение 15 мин. После этого клетки промывали 5 раз по 3 мин раствором PBS и обрабатывали 15 мин при комнатной температуре раствором PBS, содержащим 0,5 % Triton-X 100 (Sigma). Неспецифическое окрашивание блокировали инкубацией в растворе БСА (1 %), приготовленном на PBS, 30 мин при комнатной температуре. С первыми антителами клетки инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После этого промывали 3 раза по 5 мин раствором PBS, содержащим 0,1 % Tween 20 (BioRad). Инкубацию со вторыми антителами проводили 30 мин при комнатной температуре. Потом промывали, как описано выше. Для выявления актина использовался 6,6 мкМ раствор родамин-фаллоидин (Invitrogen).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»