WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Масс-спектрометрически проанализированные коровые белки культуральной среды оказалались коровыми белками ПГ бигликана (рис. 6, дорожка 2, низкомолекулярный белок), ПГ интер-альфа-ингибитора трипсина (рис. 6, дорожка 2, высокомолекулярный белок) и ПГ коллагена XII. Интер-альфа-ингибитор трипсина, очевидно, является ПГ сыворотки, поскольку есть и в культуральной среде и в ЭБС (рис. 7, А). ПГ бигликан, коровый белок которого появляется только после расщепления фракции IV ПГ культуральной среды, повидимому, синтезируется самими миобластами Влияние протеогликанов на адгезию миобластов.

ПГ ВКМ, как и ПГ культуральной среды а (далее ВКМ(КС)), нанесенные на подложку в концентрации 20 мкг/мл, полностью препятствовали адгезии миобластов (рис. 8, а). В качестве контролей использовали ПГ декорин, который подобно ПГ ВКМ(КС) содержит цепи хондроитинсульфата, и фибронектин. Декорин, как и ПГ ВКМ(КС), ингибировал адгезию б клеток (рис. 8, б), тогда как на фибронектине происходило нормальное прикрепление и распластывание клеток (рис. 8, в).

Распластывание миобластов на фибронектине ухудшалось при добавлении к нему декорина или ПГ ВКМ(КС) в концентрации в 20 мкг/мл (рис. 9, а, г), причем ПГ ВКМ(КС) ингибировали адгезию сильнее по сравнению с декорином. Увеличение концентрации декорина и ПГ до 100 мкг/мл (концентрация, необходимая для последующей ферментативной обработки) усилило их ингибирующее действие на адгезию миобластов (рис. 9, б, д), а в случае ПГ Рис. 8. Адгезия миобластов L6J1 на ВКМ(КС) вызвало агрегацию клеток (рис. 9, д).

протеогликанах ВКМ(КС) (а), декорине (б) и фибронектине (в). Здесь и на рис. Обработка субстрата, состоящего из 20 мкг/мл показаны прижизненные микрофотографии клеток. Об.10х. фибронектина и 100 мкг/мл декорина или ПГ ВКМ(КС), хондроитиназой АВС, расщепляющей цепи хондроитинсульфата, привела к нормализации адгезии и распластывания миобластов (рис. 9, в, е).

Данные, полученные при изучении адгезии миобластов под действием хондроитинсульфат ПГ, указывают на возможность участия ПГ в регуляции адгезивных свойств миобластов. ПГ ВКМ миобластов и декорин, относящиеся к классу хондроитинсульфат ПГ, подавляют адгезию миобластов. Ингибирующие адгезию действие ПГ опосредовано их углеводными цепями.

а д б г е в Рис. 9. Адгезия миобластов L6J1 на фибронектине в присутствии декорина и протеогликанов ВКМ(КС). Везде фибронектин (20 мкг/мл) и дополнительно: а – декорин (20 мкг/мл); б – декорин (мкг/мл); в – декорин (100 мкг/мл) с последующей обработкой нанесенного субстрата хондроитиназой АВС;

г – ПГ ВКМ(КС) (20 мкг/мл); д – ПГ ВКМ(КС) (100 мкг/мл); е – ПГ ВКМ(КС) (100 мкг/мл) с последующей обработкой нанесенного субстрата хондроитиназой АВС.

Влияние протеогликанов и гликозаминогликанов в комбинации с основным фактором роста фибробластов (bFGF) на пролиферацию миобластов.

ГАГ являются компонентами ПГ, и именно они связывают факторы роста, модулируя их действие на клетки, поэтому собственно ГАГ часто используют для анализа функций ПГ.

Гепарин не входит в состав ПГ, но его рассматривают как аналог гепарансульфат ПГ ткани.

Исходя из определяющей роли состава углеводных цепей ПГ в регуляции активности факторов роста, исследовали влияние ГАГ разных классов (гепарин, хондроитинсульфат, дерматансульфат) в сочетании с bFGF на пролиферацию % 250 миобластов.

* * Концентрация ГАГ была * выбрана на основе данных, приведенных в литературе (Villena and Brandan 2004).

Результаты оценки действия ГАГ как модуляторов 18ч 24ч активности bFGF приведены на контроль рис. 10. Добавление в bFGF bFGF + гепарин инкубационную среду, наряду с bFGF + дерматансульфат bFGF + хондроитинсульфат bFGF, различных ГАГ модулирует действие фактора.

Рис. 10. Действие bFGF (20 нг/мл) и гликозаминогликанов на пролиферацию миобластов L6J1.

Гепарин к 24 ч вызвал некоторое увеличение включения метки.

N = 3; приведены средние +/- SD; t-тест; * р < 0.05.

Дерматансульфат наиболее эффективно стимулировал активирующее пролиферацию миобластов действие bFGF – в точке 24 ч прирост включения метки в присутствии дерматансульфата составил 20 % по отношению к действию самого фактора. Напротив, добавление хондроитинсульфата привело даже к некоторому снижению действия bFGF. Полученные данные указывают на разнонаправленное действие различных ГАГ ПГ в комбинации с bFGF на ростовую активность миобластов. При этом гепарин и дерматансульфат могут усиливать действие ростовых факторов, тогда как в присутствии хондроитинсульфата интенсивность пролиферации миобластов имеет тенденцию к снижению.

Влияние гликозаминогликанов (хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарин) и протеогликана декорина на дифференцировку миобластов.

Фиксированные 6 сут 10 сут 14 сут клетки Рис. 11. Дифференцировка миобластов L6J1 в присутствии гликозаминогликанов (хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарин) и декорина. Показаны прижизненные фотографии клеток везде кроме последней колонки, в которой приведены снимки клеток, фиксированных на 14-е сутки культивирования и окрашенных по Романовскому-Гимзе.

Контроль Хондроитинсульфат Гепарин Декорин Дерматансульфат На рис. 11 приведены фотографии А миобластов, полученные на разных сроках контроль миотубы дифференцировки. Анализ фотографий с 800 хондроитин сульфат помощью программы ImageJ позволил декорин выделить две популяции клеток (миотубы и дерматан сульфат миобласты), которые различались по гепарин вытянутости и площади. На рис. 12 и рис. миобласты представлена динамика изменения этих параметров клеток в течение 2 нед 6 10 дифференцировки. Миобласты в целом сутки однородны по площади и вытянутости на Рис. 12. Изменение площади клетки (миобласта или миотубы) в процессе дифференцировки всех сроках культивирования, в то время миобластов на разных сроках культивирования.

как площадь и степень вытянутости миотуб Rp/Rа возрастает в ходе дифференцировки (рис. миотубы 3,контроль и рис. 13). Вытянутость миотуб в 3,3,хондроитин присутствии гепарина достоверно меньше, сульфат 3,декорин 3,чем в контроле, на всех сроках 3,дерматан 3,2 культивирования. Между тем нет различий сульфат 3,гепарин по вытянутости миотуб между остальными миобласты добавками и контролем (рис. 13).

1,1,Количество миотуб относительно 1,1,всех клеток на фотографии возрастает по 6 10 сутки мере культивирования для всех добавок (рис. 14). В случае гепарина количество Рис. 13. Изменение вытянутости клетки (миобласта или миотубы) в процессе миотуб также возрастает, но медленнее, чем дифференцировки миобластов на разных сроках культивирования.

в контроле. В присутствии гепарина появляется в среднем в 2 раза меньше % миотуб, чем в контроле (рис. 14). В контроль присутствии остальных агентов количество хондроитин сульфат миотуб достоверно не отличается от декорин контроля.

дерматан 4 сульфат гепарин Рис. 14. Изменение относительного количества миотуб 610 в процессе дифференцировки миобластов на разных сутки сроках культивирования.

Площадь клетки, отн. ед.

Коэффициент вытянутости клетки Количество миотуб ВЫВОДЫ 1) Доля протеогликанов, выделенных из всех фракций (культуральная среда, клетки и внеклеточный матрикс) культуры миобластов L6J1, составляет 0.04-0.30 % от содержания белка.

2) Основным классом протеогликанов культуры миобластов L6J1 являются хондроитин/дерматансульфат протеогликаны, составляющие 91, 51 и 65 % общего количества протеогликанов культуральной среды, клеток и внеклеточного матрикса соответственно.

3) По результатам масс-спектрометрического анализа основным хондроитинсульфатсодержащим протеогликаном культуральной среды, кондиционированной миобластами L6J1 является бигликан, а внеклеточного матрикса – версикан.

4) Протеогликаны внеклеточного матрикса миобластов L6J1 и культуральной среды, а также хондроитин/дерматансульфат декорин, препятствуют адгезии миобластов.

Ферментативная деградация углеводных цепей хондроитиназой АВС устраняет ингибирующее адгезию миобластов действие протеогликанов.

5) Углеводные компоненты протеогликанов – гликозаминогликаны – влияют на пролиферацию миобластов L6J1 в присутствии основного фактора роста фибробластов. Дерматансульфат, а также гепарин, в сочетании с фактором роста фибробластов усиливают стимулирующее пролиферацию миобластов действие фактора, тогда как хондроитинсульфат подавляет рост-стимулирующую активность фактора.

6) Гликозаминогликан гепарин замедляет дифференцировку миобластов, в то время как другие гликозаминогликаны – хондроитинсульфат, дерматансульфат – и протеогликан декорин не влияют на скорость дифференцировки. Миотубы, образующиеся в присутствии гепарина, имеют менее вытянутую форму.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Мокрушин А.Л., Морозов В.И. Протеогликаны эмбриональных фибробластов крысы RAT 2. Тр. VI Междунар. конференции «Молекулярная генетика соматических клеток», 12-16.12.2005, Москва. C. 94.

2. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Морозов В.И. Выделение протеогликанов из культуры эмбриональных миобластов крысы. 10-я Пущинская школа – конф. молодых ученых «Биология – наука XXI века», 17-21.04.2006, Пущино. С. 74.

3. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Мокрушин А.Л., Черткова Т.А., Морозов В.И.

Протеогликаны культуры трансформированных миобластов крысы L6J1. Цитология. 2006.

Т. 48. № 9. С. 762.

4. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Мокрушин А.Л., Черткова Т.А., Романюк А.В., Морозов В.И. Выделение и характеристика протеогликанов культуры миобластов крысы L6J1.

Биохимия. 2007. Т. 72. № 4. С. 560-567.

5. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Мокрушин А.Л., Черткова Т.А. Протеогликаны скелетных мышц как регуляторы активности фактора роста гепатоцитов. Тр. 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», 20-21.04.2007, Санкт-Петербург. С. 275-276.

6. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Мокрушин А.Л., Черткова Т.А., Морозов В.И. Изучение состава протеогликанов, синтезируемых трансформированными миобластами крысы L6Jв культуре. Цитология. 2007. Т. 49. № 9. С. 745.

7. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Мокрушин А.Л., Черткова Т.А., Морозов В.И.

Протеогликаны внеклеточного матрикса миобластов l6j1. Характеристика и влияние на адгезию миобластов. Тр. IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15.05.2008, Новосибирск. С. 108.

8. Ермакова И.И., Сакута Г.А., Мокрушин А.Л., Черткова Т.А., Романюк А.Л., Морозов В.И. Протеогликаны внеклеточного матрикса миобластов l6j1. Характеристика и влияние на адгезию миобластов. Цитология. 2008. Т.50. № 8. С. 692-699.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Alvarez K, Fadic R, Brandan E. (2002) J. Cell Biochem., 85, 703–713 — Bernfield M., Gtte M., Park P.W., Reizes O., Fitzgerald M.L., Lincecum J., Zako M. (1999) Annu. Rev. Biochem., 68, 729–777 — Brown C.T., Nugent M. A., Lau F. W., Trinkaus-Randall V. (1999) J. Biol.

Chem., 274, 7111–7119 — Carey D. J., Stahl R. C. (1990) J. Cell Biol., 111, 2053–2062 — Charge S.B.P., Rudnicki M.A. (2004) Physiol. Rev., 84, 209–238 — Cool S. M., Nurcombe V.

(2006) J. Cell. Biochem., 99, 1040–1051 — Cceres S., Cuellar C., Casar J.C., Garrido J., Schaefer L., Kresse H., Brandan E (2000) Eur. J. Cell Biol., 79, 173–181 — Casar J.C., Cabello-Verrugio C., Olguin H., Aldunate R., Inestrosa N.C., Brandan E. (2004) J. Cell Sci., 117, 73–84 — Droguett R, Cabello-Verrugio C, Riquelme C, Brandan E (2006) Matrix Biol., 25, 332–341 —Evanko S. P., Tammi M. I., Tammi R. H., Wight T. N. (2007) Adv. Drug. Deliv.

Rev., 59, 1351–1365 — Iozzo R.V. (1999) J. Biol. Chem., 274, 18843–18846 — Iozzo R.V., Murdoch A. D. (1996) FASEB J., 10, 598–614 — Iozzo R.V. (2000) N.Y., Marcel Dekker Inc., 442 p. — Iozzo R.V. (2001). Methods Mol. Biol., 171, 576 p. — Jin P., Sejersen T., Ringertz N.R. (1991) J Biol Chem., 266, 1245–1249 — Kresse H., Schonherr E. (2001) J. Сell. Physiol., 189, 266–274 — Kroll T.G., Peters B.P., Hustad C.M., Jones P.A., Killen P.D., Ruddon R.W.

(1994) J Biol Chem., 269, 9270–9277 — Laemmli U.K. (1970) Nature, 227, 680–685 — Langsdorf A., Do A.T., Kusche-Gullberg M., Emerson C.P.J., Ai X. (2007) Dev. Biol., 311, 464–477 — Liu C, McFarland DC, Nestor KE, Velleman SG (2006) Poult Sci., 85, 422–428 — Ruoslahti E., Yamaguchi Y. (1991) Cell, 64, 867–869 — Taipale J., Keski-Oja J. (1996) FASEB J., 11, 51–59 — Velleman S.G., Liu X., Eggen K.H., Nestor K.E. (1999) Poult. Sci., 78, 1619–1626 — Velleman S.G., Liu C., Coy C.S., McFarland D.C. (2006) Dev. Growth Differ. 48, 271–276 — Villena J., Brandan E. (2004) J. Cell Physiol., 198, 169–178 — Yanagishita M., Hascall V.C. (1987) Methods in Enzymology.,. 138, 279-289 — Young H.E., Carrino D.A., Caplan A.I. (1990) Mech. Ageing Dev., 53, 179–193.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»