WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Поиск по «пептидному фингерпринту» был проведен в базе данных NCBI среди белков млекопитающих с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом.

Изучение влияния протеогликанов на адгезию миобластов. В лунки 24-луночного планшета вносили по 20 мкг/мл ПГ культуральной среды, ПГ ВКМ, декорина, белка ВКМ фибронектина (любезно предоставлен сотрудником Института цитологии РАН Д.А.

Гамазиным) в 0.5 мл PBS. Кроме того, адгезию миобластов анализировали при использовании следующих комбинаций препаратов: 1) фибронектин (20 мкг/мл) и декорин (20 и 100 мкг/мл); 2) фибронектин (20 мкг/мл) и ПГ ВКМ(КС) (20 и 100 мкг/мл). Планшет выдерживали 8 ч при 4-6 С, убирали жидкую фазу, лунки промывали PBS и в каждую ячейку вносили 2 х 104 миобластов L6J1в 0.5 мл DMEM. Через 6 ч состояние клеток анализировали под микроскопом (ув. 100х). При изучении влияния полисахаридных цепей ПГ на адгезию миобластов клетки вносили в лунки после обработки иммобилизованного субстрата (смесь фибронектина с ПГ в концентрации 100 мкг/мл) хондроитиназой АВС.

Изучение влияния гликозаминогликанов в комбинации с фактором роста фибробластов на пролиферацию миобластов. В ячейки 24-луночного планшета высевали по 2 х 104 миобластов L6J1 в 1 мл DMEM, содержащей 10 % ЭБС. Через 1 сут полную среду убирали, клетки промывали DMEM без ЭБС и оставляли в этой же среде на 12 ч. Затем среду заменяли на такую же неполную среду, содержащую 100 нг/мл ГАГ, 20 нг/мл ростового фактора bFGF и 3 мкКи/мл [3Н]-тимидина. Через 18 или 24 ч среду убирали, клетки промывали PBS и снимали PBS, содержащим смесь трипсина и версена. Радиоактивность клеточной суспензии подсчитывали на жидкостно-сцинтилляционном счетчике LS (“Beckman”, Австрия) в сцинтилляционном коктейле на основе диоксана.

Изучение влияния гликозаминогликанов и протеогликана декорина на дифференцировку миобластов. В лунки 24-луночного планшета высевали по 105 миобластов в 1 мл полной среды. Через 2 сут инициировали дифференцировку миобластов (Jin et al., 1991; Kroll et al., 1994), заменяя полную среду на среду, содержащую 0.5 % ЭБС и различные ГАГ (гепарин, хондроитинсульфат, дерматансульфат) или ПГ декорин в концентрации мкг/мл. На 6, 10 и 14-е сутки культивирования клетки фотографировали и далее фотографии клеток анализировали с помощью программы ImageJ и полученные данные обрабатывали в программе Microsoft Office Excel. К параметрам клетки – площадь (A – area) и периметр (P – perimeter), измеренным программой ImageJ, добавляли еще один параметр – коэффициент P вытянутости клетки (Rp/Ra), рассчитанный по формуле Rp / Ra = (Rp/Ra = 1 - круглая 2 A клетка; Rp/Ra = - бесконечно вытянутая клетка). В качестве показателей дифференцировки рассчитывали: 1) количество миотуб относительно количества всех клеток nмиотуб A 100%, где n – количество клеток; 2) среднюю площадь клетки - ; 3) nмиобластов + nмиотуб n Rp / Ra.

среднюю вытянутость клетки - n РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделение протеогликанов из культуральной среды, клеток и ВКМ Таблица 1. Содержание белка и ГАГ в отдельных фракциях культуры миобластов Фракция клеточной Объем Концентрация Концентрация ГАГ (мг) Белок (мг) культуры фракции (мл) ГАГ (мкг/мл) белка (мг/мл) ВКМ 1000 0.3 100 0.3 0.Клетки 250 0.7 480 2.6 1.Культуральная среда 2500 4.3 10500 1.7 4.Примечание. Расчет количества ГАГ проведен по данным ионообменной хроматографии.

Выделение ПГ культуры миобластов было проведено из материала, собранного после наращивания 109 клеток. Объем фракций культуры миобластов – ВКМ, клеток и культуральной среды, из которых выделяли ПГ, а также количество ГАГ и белка в этих фракциях приведены в табл. 1. ГАГ не удалось определить с помощью ДМС в исходных фракциях и их количество было рассчитано по результатам ионообменной хроматографии.

Количество ПГ в исходных фракциях сопоставимо с количеством ГАГ, которые составляют, как правило, не меньше половины молекулы ПГ ВКМ I II III IV 0,по массе. Проведенные расчеты 1,1,0,свидетельствуют об очень малой концентрации 0,0,8 ПГ во всех составляющих культуры миобластов 0,0,(культуральная среда, ВКМ и миобласты) по 0,0,сравнению с концентрацией белка (табл. 1).

0 10 20 30 40 50 В результате разделения ПГ с помощью 0,Клетки I II III IV 0,ионообменной хроматографии были получены 1,0,1,2 по 4 фракции ПГ культуральной среды, ВКМ и 0,клеток (I–IV), объединенные в соответствии с 0,0,профилем элюции (рис. 2). Во всех случаях 0,0,0,1 0,первой при концентрации NaCl 0.3 М выходит 0,белковая фракция, практически не содержащая 0 10 20 30 40 50 0,ГАГ. Во второй фракции (0.4-0.5 М NaCl) КС I II III IV 0,1,содержится основная часть белка с небольшим 1,0,количеством ГАГ. Белковые пики практически 0,0,не перекрываются с пиками ГАГ, что дает 0,0,0,возможность отделить белковую фракцию от 0 0,0 50 100 150 200 фракций ГАГ. Элюция основной массы ГАГ Объем элюента, мл происходит в виде двух пиков (фракции III и IV Белок (Бредфорд - 595 нм) ГАГ (краситель ДМС - 525 нм) соответственно) при анализе ВКМ (0.5 М и 0.Рис. 2. Графики элюции с Q-сефарозы М NaCl) и культуральной среды (0.6 М и 0.8 М протеогликанов внеклеточного матрикса (ВКМ), миобластов (Клетки) и NaCl). Для клеток характерен только один пик культуральной среды (КС).

ПГ (0.65 М NaCl), тогда как другие пики ПГ не I – IV – объединенные фракции градиента выявляются.

0,ЭБС КС Наибольшее количество 0,1,ПГ присутствует в 0,1,0,культуральной среде, а 0,0,0,наименьшее – в ВКМ (табл.

0,0,1). Высокое содержание ПГ в 0 0,0 20 40 60 0 10 20 культуральной среде Объем элюента, мл ГАГ (краситель ДМС - 525 нм) заставило нас предположить, что хотя бы часть ПГ Рис. 3. Графики элюции с Q-сефарозы ПГ культуральной среды, миобластов L6J1 (КС) и эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС).

NaCl (M) NaCl (M) Оптическая плотность, отн. ед NaCl (M) NaCl (M) отн. ед.

Оптическая плотность, попадает в культуральную среду из ЭБС. Для выяснения этого вопроса было проведено выделение ПГ из среды DMEM, содержащей 10 % ЭБС, и равного объема такой же среды, кондиционированной миобластами (рис. 3). Оказалось, что высота пика и ионная сила (0.8 М NaCl), при которой наблюдается основной пик ПГ, сходны в обоих случаях. Это позволило заключить, во-первых, что в ЭБС есть ПГ и, во-вторых, что основная масса ПГ кондиционированной миобластами культуральной среды представлена ПГ ЭБС. ПГ, синтезированные самими клетками в культуральную среду, могут быть выявлены при сопоставлении электрофореграмм ПГ культуральной среды и ЭБС.

Характеристика выделенных протеогликанов.

Анализ углеводного состава ПГ. При анализе углеводного состава ПГ были использованы ферменты, специфически разрушающие хондроитин/дерматансульфаты (хондроитиназа АВС) и гепарансульфаты (гепариназа III). Обработка этими ферментами Таблица 2. Углеводный состав протеогликанов основных фракций культуры миобластов L6J1.

Культуральная среда Клетки ВКМ Показатели Геп. III С. АВС Геп. III С. АВС Геп. III С. АВС Содержание гепаран 8.7 - 19.6 - 26.1 сульфатов (%) Содержание хондроитин/ - 91.3 - 50.9 - 65.дерматансульфатов (%) Суммарное содержание гликозаминогликанов трех 100 70.5 91.классов (%) Примечание. Геп. III – гепариназа III; С. АВС – хондроитиназа АВС.

фракций, содержащих наибольшее количество ПГ (фракция III для клеток, фракции III и IV для ВКМ и культуральной среды), позволила определить конкретные классы выделенных ПГ и их относительное содержание в составляющих клеточной культуры (табл. 2).

Ферментативная обработка ПГ ВКМ и клеток выявила преобладающее содержание хондроитин/дерматансульфатов по сравнению с гепарансульфатами – 2.6:1 для клеток и 2.5:для ВКМ. ПГ культуральной среды по результатам анализа состоят более чем на 90 % из хондроитин/дерматансульфатов.

Электрофоретический анализ фракций протеогликанов ВКМ, миобластов и I II III IV кДа ВКМ - культуральной среды. Объединенные фракции ПГ (I-IV) ВКМ, миобластов и культуральной среды, -полученные в результате ионообменной -хроматографии, анализировали с помощью -электрофореза в 7 %-ном ПААГ (рис. 4). Для окраски белков в геле использовали Кумасси G250 (фиолетовая окраска), а для окраски Клетки - отрицательно заряженных ГАГ – альциановый синий (синяя окраска). Результаты - электрофоретического анализа этих фракций ПГ - полностью согласуются с графиками элюции ПГ с - Q-сефарозы (рис. 2). Исключение составила фракция II ПГ миобластов, которая дала синее окрашивание в ПААГ, но на графике элюции КС - окраски этой фракции ДМС не было получено, - что, возможно, связано с наличием в этой фракции гиалуроновой кислоты или нуклеиновых - кислот, которые окрашиваются альциановым синим, но не взаимодействуют с красителем - ДМС.

Выявление коровых белков и массРис. 4. Электрофорез в 7 %-ном ДСН-ПААГ фракций протеогликанов внеклеточного спектрометрическая идентификация выделенных матрикса (ВКМ), миобластов (клетки) и культуральной среды (КС), полученных протеогликанов. Коровые белки выделенных ПГ после разделения на Q-сефарозе.

I – IV – объединенные фракции градиента выявляли при сопоставлении электрофореграмм фракций ПГ до и после обработки ферментами.

Для анализа были взяты фракции, которые содержали максимальное количество ПГ по результатам ионообменной хроматографии: фракция III ПГ миобластов, фракции III и IV ПГ ВКМ, фракция IV культуральной среды. Согласно данным, приведенным в табл. 2, ПГ ВКМ и культуральной среды состоят преимущественно из хондроитин/дерматансульфатов, а также содержат небольшое количество гепарансульфатов. Обработка этих фракций хондроитиназой АВС и гепариназой III позволила выявить коровые белки ПГ при электрофорезе. На рис. 5 приведены данные электрофоретического анализа ПГ ВКМ после ферментативной обработки. Электрофорез фракций III и IV ПГ ВКМ показал, что ПГ обеих фракций – высокомолекулярные 1 2 3 4 5 6 7 соединения, которые не входят в 7 %-ный кДа 216 ПААГ и задерживаются на старте (рис. 5, дорожки 1 и 4 соответственно). В результате обработки фракций III и IV 120 хондроитиназой АС, специфичной в отношении хондроитинсульфатов, 76 появляются новые белковые полосы 67 (дорожки 2 и 5). При сопоставлении этих полос с картиной, которую дает сам Рис. 5. Электрофорез фракций III и IV ПГ ВКМ в 7 %-ном ДСН-ПААГ.

фермент (дорожка 7), к коровым белкам ПГ 1 – фракция III ВКМ (контроль без могут быть отнесены полоса с мол. массой фермента); 2 – фракция III ВКМ после обработки хондроитиназой АС; 3 – около 230 кДа, обнаруженная во фракции фракция III ВКМ после обработки III, и полосы в области мол. масс 140–гепариназой III; 4 – фракция IV ВКМ (контроль без фермента); 5 – фракция IV кДа, которые слабо выявляются во фракции ВКМ после обработки хондроитиназой АС;

6 – фракция IV ВКМ после обработки III (дорожка 2) и становятся более гепариназой III; 7 – хондроитиназа АС; 8 - гепариназа III.

отчетливыми во фракции IV (дорожка 5).

Полосы, выявляющиеся в контроле на фермент (дорожка 7), можно объяснить 1 2 присутствием БСА в фирменном препарате кДа хондроитиназы АС. В отличие от хондроитиназы 160 АС, обработка фракций III и IV (дорожки 3 и 6) 105 75 гепариназой IV не приводит к появлению новых полос по сравнению с контролем без 50 ферментативной обработки (дорожки 1 и 4).

Масс-спектрометрический анализ 35 коровых белков протеогликанов ВКМ показал, что высокомолекулярный коровый белок фракции III ВКМ является протеогликаном Рис. 6. Электрофорез фракции IV ПГ культуральной среды в 7 %-ном версиканом. Анализ коровых белков, ДСН-ПААГ.

выявленных во фракции IV, не дал достоверных 1 – фракция IV культуральной среды результатов. (контроль без фермента); 2 – фракция IV культуральной среды С помощью обработки ПГ фракции III после обработки хондроитиназой АВС; 3 – фермент хондроитиназа клеток смесью хондроитиназа АС и гепариназа АВС.

III был выявлен высокомолекулярный белок (>200 кДа), которого нет ни в контроле без ферментативной обработки, ни в препарате фермента, и который, по-видимому, является коровым белком ПГ клеток. При масс-спектрометрическом анализе этого белка не было получено достоверных данных, позволяющих идентифицировать ПГ.

ПГ культуральной среды по данным анализа углеводного состава практически полностью представлены хондроитин/дерматансульфат ПГ, вследствие чего они были подвергнуты ферментативному расщеплению одним ферментом хондроитиназа АВС (рис.

6). Электрофорез ПГ фракции IV культуральной среды после ферментативной обработки позволил обнаружить 2 белковые полосы, очевидно, представляющие собой коровые белки ПГ: широкую полосу с мол. массой около 40 кДа и полосу с мол. массой около 90 кДа (дорожка 2). Электрофорез этой фракции после ферментативной обработки в градиентном геле 3 – 15 % дал возможность обнаружить 1 2 1 еще один коровый белок ПГ кДа культуральной среды с мол. массой более 205 300 кДа.

116 Учитывая то, что ПГ культуральной 97 среды могут быть синтезированы 67 миобластами, а также происходить из ЭБС 55 (как было показано нами ранее), провели 45 сравнительный электрофорез ПГ культуральной среды и ЭБС. На рис. Б А представлен электрофорез фракции IV ПГ культуральной среды и ЭБС, содержащей Рис. 7. Электрофорез фракции IV ПГ эмбриональной бычьей сыворотки (А) и подавляющее количество ПГ, до и после культуральной среды (Б) в 7 %-ном ДСНПААГ.

ферментативной обработки хондроитиназой АВС. В случае ЭБС 1 – фракция IV КС(ЭБС) (контроль без фермента); 2 – фракция IV КС(ЭБС) после обработка ферментом привела к обработки хондроитиназой АВС; 3 – фермент хондроитиназа АВС.

исчезновению полосы в области 140 кДа (рис. 7, А, дорожка 1) и появлению одной новой полосы (рис. 7, А, дорожка 2), не считая полос фермента, в отличие от препарата ПГ культуральной среды, ферментативное расщепление которого привело к появлению 2 новых полос (рис. 7, Б, дорожка 2). Полоса с мол. массой около 90 кДа, которая есть в обоих препаратах, очевидно представляет собой коровый белок ПГ сыворотки. Более низкомолекулярный белок в районе 40 кДа, проявившийся только в препарате культуральной среды, по-видимому, является коровым белком ПГ, синтезированного самими миобластами.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»