WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ЕРМАКОВА Ирина Игоревна ПРОТЕОГЛИКАНЫ КУЛЬТУРЫ МИОБЛАСТОВ L6J1: ХАРАКТЕРИСТИКА И ВЛИЯНИЕ НА АДГЕЗИЮ, ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ МИОБЛАСТОВ 03.00.25 – гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный консультант: доктор биологических наук МОРОЗОВ ВЛАДИМИР ИГОРЕВИЧ Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ВОРОБЬЕВ ВЛАДИМИР ИОСИФОВИЧ Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург кандидат биологических наук КУЛЬМИНСКАЯ АННА АЛЕКСЕЕВНА Петербургский институт ядерной физики РАН им. Б П. Константинова, Гатчина

Ведущая организация: НИИ экспериментальной медицины РАМН, СанктПетербург

Защита состоится 19 декабря 2008г. в 15 ч на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

факс: (812) 297-0341 e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан ‘‘’’ ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных задач клеточной биологии является изучение механизмов взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, который не только служит структурным каркасом ткани, но и влияет на рост и развитие контактирующих с ним клеток. Интенсивно развивающимся направлением таких исследований является выяснение функциональной роли протеогликанов – большого класса мультифункциональных соединений внеклеточного матрикса, состоящих из корового белка, ковалентно связанного с одной или более полисахаридными цепями – гликозаминогликанами. Эти углеводные цепи в значительной степени сульфатированы и несут большой отрицательный заряд, благодаря которому протеогликаны сильно гидратированы, что важно для обеспечения механической прочности ткани (Iozzo and Murdoch, 1996). С другой стороны, появляется все больше данных, подтверждающих разнообразные регуляторные функции протеогликанов (Iozzo, 2000; Kresse and Schonherr, 2001; Cool and Nurcombe, 2006; Evanko et al., 2007). Этим соединениям отводят роль модуляторов активности ростовых факторов (Ruoslahti and Yamaguchi, 1991; Iozzo and Murdoch, 1996; Langsdorf et al 2007), секретируемых клетками ферментов и их ингибиторов (Bernfield et al., 1999; Iozzo, 2000). С регуляторными молекулами, такими, например, как факторы роста, взаимодействуют углеводные цепи протеогликанов, усиливая или подавляя действие факторов (Taipale and Keski-Oja, 1996). Протеогликаны влияют на адгезию и миграцию клеток, участвуют в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки (Iozzo, 2000).

Большой интерес протеогликаны вызывают в связи с развитием и регенерацией мышечной ткани (Velleman et al., 2006; Liu C. еt al., 2006; Droguett et al., 2006). На участие протеогликанов в миогенезе указывают данные об увеличении их синтеза в скелетных мышцах в условиях регенерации ткани при патологиях (Alvarez et al., 2002) или при повреждении (Caceres et al., 2000; Casar et al., 2004). Показано, что миогенез в ходе эмбрионального развития и при регенерации поврежденной мышцы сопровождается изменением спектра протеогликанов (Young et al., 1990; Velleman et al., 1999; Casar et al., 2004). Состав протеогликанов изменяется в ходе миогенеза на фоне динамичных изменений структуры мышечной ткани: происходит активация сателлитных клеток, их пролиферация и слияние с образованием миотуб, из которых формируются мышечные волокна (Charge & Rudnicki, 2004). Эти процессы невозможны без участия компонентов внеклеточного матрикса, в том числе протеогликанов, которые могут, как влиять на взаимодействие миобластов с внеклеточным матриксом, так и регулировать действие ростовых факторов (bFGF, HGF и TGFb), контролирующих пролиферацию и дифференцировку этих клеток (Velleman et al., 1999). Несмотря на значительное количество работ, посвященных выяснению роли протеогликанов в регуляции процессов миогенеза, конкретные функции протеогликанов и механизмы их участия в этих событиях остаются в большой степени на уровне предположений.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении характеристик протеогликанов, синтезируемых миобластами L6J1, и исследовании их влияния на адгезию, пролиферацию и дифференцировку этих клеток.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) выделить протеогликаны культуры миобластов;

2) определить основные классы протеогликанов культуры миобластов по составу гликозаминогликанов;

3) идентифицировать основные протеогликаны культуры миобластов;

4) изучить влияние протеогликанов/гликозаминогликанов на адгезию миобластов;

5) исследовать действие протеогликанов/гликозаминогликанов на пролиферацию миобластов;

6) изучить действие протеогликанов/гликозаминогликанов на дифференцировку миобластов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хондроитинсульфат-содержащие протеогликаны являются преобладающим классом протеогликанов во всех составляющих культуры миобластов L6J1 – внеклеточном матриксе, клетках и культуральной среде.

2. Основным протеогликаном внеклеточного матрикса миобластов является версикан, а основным протеогликаном культуральной среды, кондиционированной миобластами, – бигликан.

3. Гликозаминогликаны – углеводные компоненты протеогликанов – влияют на пролиферацию миобластов, модулируя активность фактора роста bFGF: гепарин (аналог гепарансульфата ткани) и дерматансульфат увеличивают, а хондроитинсульфат снижает пролиферацию миобластов в присутствии bFGF.

4. Гликозаминогликан гепарин замедляет дифференцировку миобластов.

Научная новизна. Впервые проведено выделение и изучены характеристики протеогликанов культуры миобластов L6J1. Показано, что хондроитинсульфат-содержащие протеогликаны представляют основной класс этих соединений в культуральной среде, внеклеточном матриксе и самих миобластах. В качестве мажорных протеогликанов культуры миобластов идентифицированы хондроитинсульфат-содержащие протеогликаны бигликан и версикан, причем впервые показано, как они распределяются в культуре клеток: версикан остается в составе внеклеточного матрикса, а бигликан синтезируется клетками в среду культивирования. Проведено систематическое исследование влияния протеогликанов/гликозаминогликанов на основные функции клетки, включая адгезию, пролиферацию и дифференцировку миобластов. Впервые показано, что протеогликаны, синтезированные миобластами, подавляют их адгезию, причем устранение углеводных цепей протеогликанов с помощью ферментов приводит к нормальному прикреплению и распластыванию миобластов. Обнаружено различное влияние разных классов гликозаминогликанов на пролиферацию миобластов в присутствии bFGF: гепарин и дерматансульфат ускоряют рост клеток, а хондроитинсульфат снижает пролиферацию миобластов. В экспериментах по дифференцировке миобластов впервые обнаружено, что гепарин замедляет образование миотуб из миобластов.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа имеет фундаментальный характер и направлена на изучение роли протеогликанов в регуляции клеточных функций. В то же время полученные данные могут составить основу для разработки новых подходов, способных ускорить восстановление повреждений мышечной ткани.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи и 6 тезисов.

Основные положения работы были представлены на VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток», на 10-й Пущинской школе – конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», на 10-й Всероссийской медикобиологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре», на II съезде Общества клеточной биологии, на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов и на научных семинарах Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающих 160 ссылок. Диссертация изложена на 106 страницах и иллюстрирована 39 рисунками и 8 таблицами.

Работа выполнена при финансовой поддержке СПб НЦ РАН (проекты 2-63-2005, 2-712006 и 2-95-2007).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирование миобластов L6J1. Трансформированные миобласты крысы L6Jбыли получены из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки культивировали при 37 С в атмосфере 5 % СО2 в среде DMEM, содержащей 10 % Культура Клеточный слой клеток Снятие клеток буфером В Культуральная среда Осадок - КЛЕТКИ Супернатант - ВКМ Добавление 2 V буфера А Обработка клеток буфером С Экстракция ПГ из различных фракций клеточной культуры с Супернатант Осадок помощью анионообменного сорбента Q-сефароза Состав буферов (рН 7.0):

Буфер А –10М мочевина, 50мМ Tris-HCl, Ионообменная хроматография 10 мМ EDTA, 1мМ PMSF, 10 мМ NEM Буфер В –1М мочевина, 50мМ Tris-HCl, 1. Промывка колонки буфером D 50 мМ EDTA, 1мМ PMSF, 10 мМ NEM 2. Промывка колонки буфером E Буфер С –8М мочевина, 50мМ Tris-HCl, 3. Элюция ПГ с помощью линейного 0.1% Triton X-100, 1мМ PMSF, 10 мМ NEM градиента 0.2-1.5 M NaCl Буфер D–8М мочевина, 50мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA Диализ Буфер E–0.2MNaCl, 8М мочевина, 50мМ Tris-HCl, 10 мМ EDTA Лиофилизация Рис. 1. Схема выделения протеогликанов из культуры миобластов L6J1.

эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС). Прижизненные фотографии клеток делали с помощью камеры Canon на микроскопе Carl Zeiss, Германия, об. 10х (адгезия миобластов) и с помощью встроенной камеры на микроскопе Nicon Eclipse TS-100, об. 10х (дифференцировка миобластов).

Выделение протеогликанов. Для выделения ПГ из культуры миобластов L6J1 была использована комбинация методов, описанных в литературе (Yanagishita et al., 1987; Carey et al., 1990; Brown et al., 1999; Iozzo, 2001). Процедура выделения ПГ из культуральной среды, ВКМ и миобластов была сходной и состояла, за исключением первого этапа, из ряда общих стадий (рис. 1). Первый этап включал обработку культуральной среды двойным объемом буфера A. Клетки и ВКМ снимали с поверхности флаконов с помощью пластиковых скребков буфером В. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 20 мин при 4 °С и 100 g (rср 9 см). Супернатант, содержащий компоненты ВКМ, использовали для выделения ПГ ВКМ, осажденные миобласты лизировали буфером С и лизат клеток осветляли с помощью центрифугирования в течение 20 мин при 4 °С и 2000 g (rср 9 см). Далее все составляющие клеточной культуры (культуральная среда, ВКМ и миобласты) обрабатывали в течение 2 ч сорбентом Q-сефароза при постоянном перемешивании для извлечения ПГ.

Сорбент помещали в колонки, которые последовательно промывали буфером D и буфером Е (по 25 объемов колонки). Элюцию ПГ с Q-сефарозы проводили в градиенте концентрации NaCl (0.2-1.5 М) (20 объемов колонки). Содержание белка во фракциях определяли по Бредфорд, содержание ПГ – с помощью красителя 1,9-диметилметиленовый синий (ДМС).

Фракции градиента объединяли (объединенные фракции I–IV) с учетом профиля элюции, диализовали, концентрировали с помощью ультрафильтрации и лиофилизировали.

Анализ углеводного состава протеогликанов. Ферментативное расщепление ПГ с целью анализа состава ГАГ проводили с помощью ферментов хондроитиназа АВС, специфически расщепляющая хондроитин/дерматансульфаты, и гепариназа III, специфически расщепляющая гепарансульфаты. Лиофилизированные фракции, содержащие максимальное количество ПГ, растворяли в буфере, рН 7.5, оптимизированном для обоих ферментов и содержавшем 50 мМ Tris-НСl, 100 мМ NaCl, 4 мМ CaCl2. Для каждой фракции готовили 3 пробы: 1) контроль – без добавления фермента; 2) 0.4 ед/мл гепариназы III (°C); 3) 0.5 ед/мл хондроитиназы ABC (37 °C). Ферментативное расщепление ГАГ проводили в течение 5 ч. Ход реакции прослеживали по уменьшению концентрации ГАГ, которую оценивали с помощью ДМС. Содержание ГАГ рассчитывали по разнице оптической плотности образца ПГ, не содержащего ферменты, и образца, обработанного каждым из ферментов в отдельности, в соответствии с формулой:

A0 - А'ГАГ (%) =, где A0 - оптическая плотность исходного образца без Афермента, А'525 - оптическая плотность образца после обработки одним из ферментов.

Электрофоретический анализ коровых белков протеогликанов. Анализ коровых белков ПГ культуры миобластов проводили в процессе электрофореза материала, полученного после обработки ферментами хондроитиназа АВС, хондроитиназа АС (специфически расщепляет хондроитинсульфаты) и гепариназа III. Лиофилизированные фракции растворяли в воде, измеряли концентрацию белка и ГАГ и готовили 3 пробы для каждой фракции из расчета 5 мкг ГАГ в пробе (как описано выше). В пробы 2 и 3 добавляли 4-кратный буферный раствор, содержащий 100 мМ Tris-НСl, рН 7.5, 200 мМ NaCl, 16 мМ CaCl2 в случае гепариназы III, и 200 мМ Tris-НСl, рН 7.3, 240 мМ NaOAc в случае хондроитиназы АС и АВС (проба : буфер – 3 : 1). По завершении ферментативной обработки пробы анализировали с помощью электрофореза в 7 %-ном ПААГ (Laemmli, 1970). Гели последовательно окрашивали 0.1 % альциановым синим в растворе 50 %-ого этанола и 10 %ной уксусной кислоты в течение 2 ч, после чего отмывали тем же раствором без красителя, затем окрашивали 0.1 % Кумасси R-250 в растворе 10 %-ной уксусной кислоты и 5 %-ого этанола, после чего гель отмывали тем же раствором без красителя. Далее для идентификации ПГ проводили масс-спектрометрический анализ коровых белков ПГ, выявленных в результате ферментативной обработки и электрофореза.

Масс-спектрометрический анализ протеогликанов. Идентификацию ПГ осуществляли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF в НИИ физико-химической медицины МЗ РФ (Москва) при участии М. Серебряковой, а также в AG Bioanalytic (Leipzig) при участии М. Федоровой. Масс-спектры были получены на тандемном MALDIвремяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером. Масс-спектры анализировали при помощи программы Mascot.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»