WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Табл. 10 Процент in vivo развившихся эмбрионов мыши с характерным рисунком ДНК метилирования Таким образом, у зигот как крыс, так и мышей происходит изменение рисунка метилирования ДНК, но с разной динамикой. Первое обнаружение мужского и женского пронуклеуса возможно через 3 ч после копуляции у мыши и через 6 ч у крысы. В 10 ч после копуляции мужской пронуклеус у мыши полностью деметилирован, а у крысы в то же время частично. Эти отличия можно объяснить видовой спецификой. Обнаружены различия в уровне метилирования ДНК у эмбрионов, развивающихся in vitro по сравнению с эмбрионами, развивающимися in vivo как у крыс, так и у мышей.

Рис. 4.

Деметилирование мужского пронуклеуса у ранних эмбрионов мыши.

Ядра эмбрионов окрашены FITC-связанными антителами против 5-MeС группы (зелёный цвет):

(A, C, E, G, I, K) и контрастированы DAPI (голубой цвет):

(B, D, F, H, J, L) развитие in vivo: A - J система in vitro: K, L Масштабная линейка мкм.

Метилирование у партеногенетических и клонированных эмбрионов Был исследован уровень метилирования у партеногенетических и клонированных эмбрионов крысы. У партеногенетических эмбрионов наблюдался высокий уровень метилирования ДНК как на 1-клеточной стадии, так и на 2- и 4-клеточной стадии по сравнению с контролем (естественное оплодотворение), динамика деметилирования отсутствует. Клонированные 2-клеточные эмбрионы также отличаются высоким уровнем метилирования.

Рис. 5. Метилирование у партеногенетических эмбрионов крысы.

Ядра эмбрионов окрашены FITC связанными антителами против 5-MeC группы (зелёный цвет) (A, C, E, G, I, K) и контрастированы DАРI (голубой цвет) (B, D, F, H, J, L). Масштабная линейка мкм.

А-5 ч после активации ооцита. С – 1-клеточный партеногенетический эмбрион через10 ч после активации ооцита. Е – 1-клеточный партеногенетический эмбрион через16 ч после активации ооцита. G –2- клеточный партеногенетический эмбрион через 24 ч после активации ооцита. I –2- клеточный партеногенетический эмбрион через 30 ч после активации ооцита. К –4 клеточный партеногенетический эмбрион через 48 ч после активации ооцита. Все партеногенетические эмбрионы сильно метилированы.

Рис. 6. Метилирование у клонированных эмбрионов крысы.

Ядра эмбрионов и кумулюсных клеток окрашены FITCсвязанными антителами против 5MeC группы (зелёный цвет) (A, C, E) и контрастированны DАРI (голубой цвет) (B, D, F).

Масштабная линейка 20 мкм.

А, В – 1-клеточный клонированный эмбрион, 10 ч после активации ионами стронция.

С, D – 2-клеточный клонированный эмбрион, 30 ч после активации ионами стронция E, F – кумулюсные клетки Выводы 1. Партеногенетическую активацию ооцитов крыс удаётся получить при действии различных активационных агентов: стронция, электроимпульса, этилового спирта.

Воздействие ионов стронция (Sr+) оказалось наиболее эффективным. Этот агент подходит для активации ооцитов крыс всех возрастов, даёт бОльшую долю животных, ооциты которых активируются с высокой частотой (так называемые «активные» животные) и обеспечивает высокую эффективность активации. Старые ооциты крыс (22-27 ч после инъекции хорионического гонадотропина человека — ХГЧ) склонны к спонтанной партеногенетической активации.

2. Способность ооцитов крыс к партеногенетической активации зависит от времени между инъекцией ХГЧ и моментом извлечения ооцитов из животного; более старые ооциты активируются с большей частотой (у «активных» животных). Эффективность партеногенетической активации у «неактивных» крыс не изменяется с увеличением возраста ооцита.

3. У крыс после активации стронцием, электроимпульсом, этиловым спиртом, а также после спонтанной активации с последующей диплоидизацией при помощи цитохалазина Б ооциты способны развиваться до стадии бластоцисты in vitro и до имплантации in vivo.

4. Этопозид не влияет на партеногенетическую активацию ооцитов крыс (формирование видимого пронуклеуса) и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие. При пересадке в такие ооциты ядер кумулюсных клеток (клонирование) процент получающихся 2-клеточных эмбрионов практически одинаков как после химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации.

5. Эмбрионы, культивируемые in vitro со стадии ранней зиготы до 2-клеточной стадии, имеют более высокий уровень метилирования чем эмбрионы in vivo (то же наблюдается и у мышей).

6. Динамика деметилирования ДНК в нормальных зиготах крыс и мышей различна.

Впервые мужской и женский пронуклеусы можно наблюдать у крыс через 6 ч после копуляции и через 3 ч у мышей. Через 10 ч после копуляции мужской пронуклеус у мыши полностью деметилирован, в то время как у крысы при аналогичных условиях — частично.

Эти особенности можно объяснить видовыми различиями.

7. У партеногенетических эмбрионов вплоть до 4-клеточной стадии наблюдается высокий уровень метилирования, деметилирование отсутствует. Клонированные 2клеточные эмбрионы также отличаются высоким уровнем метилирования.

Список публикаций по теме диссертации Krivokharchenko A., Popova E., Zaitseva I., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2003. Development of parthenogenetic rat embryos. Biol. Reprod. 68:829-36.

Zaitseva I., Zaitsev S., Alenina N., Bader M., Krivokharchenko A. 2007. Dynamics of DNAdemethylation in early mouse and rat embryos developed in vivo and in vitro. Mol. Reprod.

Dev.74:1255-61.

Зайцева Ю.А., Бадер М., Кривохарченко А.С. 2008. Получение двухклеточных реконструированных эмбрионов крысы после химической инактивации этопозидом хромосом ооцитов на стадии метафазы II. Онтогенез. 38: 340-Krivokharchenko A., Popova E., Zaitsewa I., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2002.

Parthenogenetic activation of rat embryos

Abstract

Book, p.196. 6-7 18-th Scientific Meeting of European Embryo Transfer Association, Rolduc, Niederlande.

Zaitseva I., Krivokharchenko A., Popova E., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2003.

Chemical enucleation of rat oocytes. Proceed of XVII Working Meeting “Genetic Resource Conservation”, 19-21 November, Pushchino, Russia.

Список цитируемой литературы Barton S. C., Arney K. L., Shi W., Niveleau A., Fundele R., Surani M. A., Haaf T. 2001. Genomewide methylation patterns in normal and uniparental early mouse embryos. Hum. Mol. Genet. 10:

2983-7. — Beaujean N., Taylor J. E., McGarry M., Gardner J. O., Wilmut I., Loi P., Ptak G., Galli C., Lazzari G., Bird A. 2004c. The effect of interspecific oocytes on demethylation of sperm DNA.

Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101: 7636-40. — Bjerregaard B., Wrenzycki C., Strejcek F., Laurincik J., Holm P., Ochs R. L., Rosenkranz C., Callesen H., Rath D., Niemann H. 2004. Expression of nucleolar-related proteins in porcine preimplantation embryos produced in vivo and in vitro. Biol. Reprod. 70: 867-76. — Elsheikh A. S., Takahashi Y., Katagiri S., Kanagawa H. 1998. Functional enucleation of mouse metaphase II oocytes with etoposide. Jpn. J. Vet. Res. 45: 217-20. — Fulka J., Jr., Notarianni E., Passoni L,. Moor R. M. 1993. Early changes in embryonic nuclei fused to chemically enucleated mouse oocytes. Int. J. Dev. Biol. 37: 433-9. — Henery C. C., Kaufman M. H.

1993. The incidence of aneuploidy after single pulse electroactivation of mouse oocytes. Mol. Reprod. Dev. 34: 299-307. — Jiang J. Y., Mizuno S., Mizutani E., Sasada H., Sato E. 2002. Parthenogenetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitro. Mol. Reprod. Dev. 61: 120-5.

— Kaufman M. H. 1973. Parthenogenesis in the mouse. Nature. 242: 475-6. — Liu L., Trimarchi J.

R., Keefe D. L. 2002. Haploidy but not parthenogenetic activation leads to increased incidence of apoptosis in mouse embryos. Biol. Reprod. 66: 204-10. — Marcus G. J. 1990. Activation of cumulus-free mouse oocytes. Mol. Reprod. Dev. 26: 159-62. — Mayer W., Niveleau A., Walter J., Fundele R., Haaf T. 2000. Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature. 403: 501-2. — Miyoshi K., Kono T., Niwa K. 1997. Stage-dependent development of rat 1-cell embryos in a chemically defined medium after fertilization in vivo and in vitro. Biol. Reprod. 56: 180-5. — Niemann H., Wrenzycki C. 2000. Alterations of expression of developmentally important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions: implications for subsequent development.

Theriogenology. 53: 21-34. — Niemann H., Wrenzycki C., Lucas-Hahn A., Brambrink T., Kues W.

A., Carnwath J. W. 2002. Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos and their implications for early development. Cloning. Stem. Cells. 4: 29-38.

— O'Neill G. T., Kaufman M. H. 1988. Influence of postovulatory aging on chromosome segrega tion during the second meiotic division in mouse oocytes: a parthenogenetic analysis. J. Exp. Zool.

248: 125-31. — Popova E., Bader M., Krivokharchenko A. 2006. Full-term development of rat after transfer of nuclei from two-cell stage embryos. Biol. Reprod. 75: 524-30. — Reik W., Dean W.

2001. DNA methylation and mammalian epigenetics. Electrophoresis. 22: 2838-43. — Rybouchkin A., Dozortsev D., de Sutter P. D., Dhont M. 1996. Factors affecting the role of the spindle during early response of mouse oocytes to ethanol stimulation. J. Exp. Zool. 275: 469-75. — Santos F., Hendrich B., Reik W., Dean W. 2002. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. Dev. Biol. 241: 172-82. — Shi W., Haaf T. 2002. Aberrant methylation patterns at the two-cell stage as an indicator of early developmental failure. Mol. Reprod. Dev. 63: 329-34. — Young L. E., Beaujean N. 2004. DNA methylation in the preimplantation embryo: the differing stories of the mouse and sheep. Anim. Reprod. Sci. 82-83: 61-78. — Zernicka-Goetz M. 1991. Spontaneous and induced activation of rat oocytes. Mol. Reprod. Dev. 28: 169-76. — Zhou Q., Renard J.

P., Le Friec G., Brochard V., Beaujean N., Cherifi Y., Fraichard A., Cozzi, J. 2003. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302: 1179.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»