WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Партеногенетическое развитие эмбрионов крыс Для оптимизации протокола клонирования у крыс тестировали различные методы партеногенетической активации, такие как электроимпульс, этиловый спирт, стронций, в зависимости от возраста ооцита. Максимально ранние ооциты удалось получить через 10 - ч после инъекции хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Была замечена вариабельность эффективности активации в зависимости от индивидуальных особенностей конкретной крысы, поэтому животных разделяли на «активные» (эффективность активации более 40 % ) и «неактивные» (эффективность активации менее 20 %). Данные, полученные в работе, представлены с учётом этого фактора. Наблюдаемую вариабельность можно объяснить генетическими различиями в аутбредной линии Wistar, влиянием материнского генома на партеногенетическую активацию ооцитов крыс. Подобное влияние материнского генома на партеногенетическую активацию прослеживается и у мышей (Мarcus 1990; Rybouchkin et al., 1996). Генетические различия сильнее проявляются при работе с ранними ооцитами крыс. Экспериментальные данные отражены на рис. 1.

“активные” животные “неактивные” животные 12-14 16-18 20-22 22-24 ч. после иньекции ХГЧ Рис. 1. Доля активированных этиловым спиртом ооцитов от всех ооцитов, полученных из животного, в зависимости от времени после инъекции хорионического гонадотропина человека.

Исходя из представленных результатов можно утверждать, что индивидуальные различия от крысы к крысе менее заметны и число «активных» животных возрастает с увеличением времени после инъекции ХГЧ.

Этиловый спирт – наиболее часто используемый активирующий агент для ооцитов млекопитающих. Как видно на рис. 1, использование этилового спирта для партеногенетической активации эффективно только для старых ооцитов крыс (22-24 ч после инъекции ХГЧ). Доля «активных животных», а также эффективность формирования пронуклеуса и дробления ооцитов крыс выше у данной возрастной группы (табл. 1).

% активированных ооцитов Табл. 1. Индуцированная этиловым спиртом партеногенетическая активация у крыс.

* Отсутствие «активных» животных. Различия в группе «активных» крыс достоверны (Р 0.05): а – б. В скобках — абсолютные значения.

Стимуляция электроимпульсом также эффективна для партеногенетической активации ооцитов крыс (табл. 2). У молодых ооцитов (12-14 ч после инъекции ХГЧ) доля ооцитов с сформировавшимся пронуклеусом и доля дробящихся ооцитов существенно выше по сравнению со стимуляцией этиловым спиртом той же возрастной группы.

Табл. 2. Электроактивация ооцитов крыс.

* Отсутствие активированных ооцитов. В скобках — абсолютные значения. Различия в группе «активных» крыс достоверны (Р 0.05): а – б.

В проведённых экспериментах партеногенетическую активацию очень эффективно вызывало культивирование крысиных ооцитов в среде, содержащей ионы стронция (2 мM Sr +). Как видно на табл. 3, кратковременное воздействие ионами стронция (15 мин) оказалось вполне достаточным для партеногенетической активации ооцитов крыс. Количество «активных» животных в группе, соответствующей 16-18 ч после инъекции ХГЧ, было значительно ниже, чем у более старых ооцитов. Доля ооцитов с сформировавшимся пронуклеусом и доля дробящихся ооцитов была практически одинакова у всех возрастных групп.

Табл. 3. Активация эмбрионов крысы 15-минутной обработкой ионами стронция.

Отсутствие активированных ооцитов. # Отсутствие «неактивных» животных. В скобках — абсолютные значения.

Повышение времени инкубации с 15 мин до 2 ч не приводило к существенным изменениям в эффективности формирования пронуклеуса и дробления, доля «активных» животных росла вместе с увеличением времени после инъекции ХГЧ (табл. 4).

Табл. 4. Активация крысиных эмбрионов 2-часовой обработкой стронцием.

Крысиные ооциты подвержены спонтанной активации с формированием пронуклеуса и делением без какой-либо обработки и без применения гиалорунидазы (табл. 5). Способность к формированию пронуклеуса и эффективность активации зависит от возраста ооцита.

Спонтанная активация возможна у ооцитов начиная с 22–24-го ч после инекции ХГЧ и максимальна у очень старых ооцитов 25–27 ч. Тем не менее, остаётся неизвестным фактор, вызывающий спонтанную активацию. У мышей триггером является гиалуронидаза (Kaufman 1973; O'Neill and Kaufman 1998; Henery and Kaufman 1993). В проведённых экспериментах старые ооциты были изолированы без участия гиалуронидазы и, тем не менее, спонтанно активировались. Этот эффект может вызвать охлаждение ооцитов во время извлечения из яйцевода (Jiang et al., 2002).

Табл. 5. Спонтанная активация крысиных ооцитов.

* Отсутствие активированных ооцитов.

Различия в группе «активных» крыс достоверны (Р 0.05).

Этиловый спирт, электроимпульс, стронций, активируют ооциты крыс, однако развитие эмбриона без диплоидизации останавливается на 2-клеточной стадии (Jiang et al., 2002). Проблема преодолевается использованием цитохалазина Б, который подавляет выделение второго полярного тельца, и в результате получается зигота с двумя пронуклеусами (Liu et al., 1998). Впервые, после партеногенетической активации и диплоидизации при помощи цитохалазина Б, были получены партеногенетические бластоцисты крысы (табл. 6). Не наблюдалось значительной разницы в дроблении и формировании бластоцист между экспериментальными и контрольной группами. Доля ооцитов, сформировавших бластоцисты, черезвычайно низка при активации стронцием 12– 14-часовых ооцитов по сравнению с контрольной группой.

Табл. 6. Развитие in vitro партеногенетически активированных крысиных ооцитов.

* Естественное оплодотворение. Различия достоверны (Р 0.05): а – б.

Изучение возможности применения этопозида для химической энуклеации ооцитов крыс на стадии метафазы II Одним из важных этапов клонирования является энуклеация – удаление генетического материала ооцита. В настоящее время для энуклеации ооцитов млекопитающих существуют два различных подхода: механический и химический.

Механический способ заключается в извлечении хромосом при помощи микропипетки. Этот метод связан с высокой степенью травматичности, что снижает эффективность всей манипуляции. Химический способ привлекателен возможностью существенно упростить и ускорить процедуру энуклеации. На данный момент опубликованы данные, указывающие на возможность применения этопозида для химической энуклеации мышиных ооцитов на стадиях метафазы I (Fulka et al., 1993) и метафазы II (Elsheikh et al., 1998).

Как видно на табл. 7, культивирование ооцитов крыс в среде, содержащей этопозид не оказывало влияния на способность ооцитов к активации стронцием. В то же время этопозид достоверно снижал процент активированных ооцитов, достигших 2-клеточной стадии по сравнению с контролем (естественные зиготы) (P < 0.05). Этопозид является специфическим ингибитором фермента ДНК-топоизомеразы 2, который ответственен за скручивание и разделение цепей ДНК. В наших опытах этопозид не оказывал влияния на партеногенетическую активацию ооцитов и, в то же время, необратимо блокировал их дальнейшее развитие. Поэтому можно предположить, что химическая энуклеация ооцитов этопозидом может быть использована при клонировании крысы.

Табл. 7. Влияние этопозида на развитие крысиных эмбрионов.

Были проведены сравнительные эксперименты по выяснению процента выживания эмбрионов крыс после процедуры клонирования как при помощи химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации (табл. 8). B качестве донора генетической информации использовали кумулюсные клетки.

Табл. 8. Сравнительная таблица выживания ооцитов и эмбрионов крыс на разных этапах клонирования при использовании химической или механической энуклеации.

* Воздействие этопозидом не проводилось Как видно на табл. 8, выживаемость эмбрионов крыс от этапа к этапу клонирования практически одинакова вне зависимости от способа энуклеации ооцитов. Доля 2-клеточных клонированных эмбрионов крысы составляет 16 % как при клонировании с применением химической энуклеации, так и при клонировании с применением механической энуклеации.

К сожалению, дальнейшая оценка выживаемости клонированных крысиных эмбрионов in vitro практически невозможна, поскольку развитие останавливается на 2-клеточной стадии вне зависимости от применяемого протокола клонирования (Jiang et al., 2002; Popova et al., 2006). Подобная особенность не встречается у клонированных эмбрионов других животных.

Динамика деметилирования у ранних крысиных и мышиных змбрионов при развитии in vivo и in vitro Для лучшего понимания процессов, происходящих в ранних предимплантационных эмбрионах, была исследована динамика деметилирования ДНК у эмбрионов крыс и мышей при помощи иммуноокрашивания с антителами против 5-МеС группы.

Впервые детальный анализ динамики деметилирования был проведён у эмбрионов крыс, развивающихся в системе in vivo. При помощи окрашивания на 5-МеС группу были проанализированны 205 эмбрионов различных возрастов в системах in vivo и in vitro. Доля эмбрионов с характерным рисунком метилирования (т. е. наиболее часто встречающимся рисунком метилирования для данной временной точки) варьирует от 67 до 100 % (табл. 9).

Нехарактерный рисунок метилирования может служить индикатором ненормального развития эмбриона (Barton et al., 2001; Shi and Haaf, 2002).

Табл. 9. Доля эмбрионов крыс с характерным рисунком ДНК метилирования; развитие in vivo и in vitro Чтобы выяснить временную хронологию деметилирования генома крысы, был использован метод датированной беременности для определения времени копуляции.

Первый контакт ооцита и сперматозоида у крыс наблюдался через 4 ч после копуляции.

Через 6 ч у зигот, развивавшихся в системах как in vivo так и in vitro, пронуклеусы при окрашивании на 5-МеС группу выглядели одинаково, причём мужской пронуклеус был более деконденсирован и выглядел крупнее чем женский пронуклеус крысы (рис. 2, A, - in vivo, C, - in vitro). Через 10 ч после копуляции мужской пронуклеус в системе in vivo частично метилирован в сравнении с сильно метилированным мужским пронуклеусом в системе in vitro (рис. 2, E, - in vivo, G, - in vitro). Через 16 ч после копуляции у крысиной зиготы мужской пронуклеус в системе in vitro сохраняет высокий уровень метилирования по сравнению с практически полностью деметилированным мужским пронуклеусом в системе in vivo (рис. 2, I, - in vivo, K, - in vitro). Женский пронуклеус в обеих группах остаётся полностью метилированным.

Рис. 2. Деметилирование мужского пронуклеуса у ранних крысиных эмбрионов, развивавшихся in vivo и in vitro.

Ядра эмбрионов окрашены FITC-связанными антителами против 5-МеС группы (зелёный цвет) (A, C, E, G, I, K, M, O, Q, S) и контрастированы DАРI (голубой цвет) (B, D, F, H, J, L, N, P). Масштабная линейка 20 мкм. A, B, E, F, I, J, M, N, Q, R: развитие in vivo. C, D, G, H, K, L, O, P, S, T: развитие in vitro.

Количественный анализ уровня флуоресценции показывает, что разница в метилировании мужского пронуклеуса зиготы крысы через 10, а также через 16 ч после копуляции в системах in vivo и in vitro достоверно различается (Р < 0.05), в то время как уровень ДНК-метилирования в женском пронуклеусе остаётся неизменным (рис. 3).

Эмбрионы крысы, развивавшиеся до 2-клеточной стадии в разных условиях (24 или 30 ч после копуляции, in vivo и in vitro), показывают разный уровень метилирования - более высокий в системе in vitro (рис. 2, M, Q, O, S). Данный факт согласуется с исследованиями других авторов. Так, в работе Ши (Shi and Haaf, 2002) показано, что у эмбрионов мыши, культивитуемых в системе in vitro, ненормальное метилирование согласуется с качеством среды культивирования.

# *** *** # *** 6 ч 10 ч 16 ч Рис. 3. Изменения уровня метилирования в мужском пронуклеусе у ранних эмбрионов крысы, развивавшихся in vivo и in vitro.

1 - мужской пронуклеус зиготы в системе in vivo 2 - мужской пронуклеус зиготы в системе in vitro 3 - женский пронуклеус эиготы в системе in vivo 4 - женский пронуклеус эиготы в системе in vitro Уровень метилирования оценивался по интенсивности флуоресценции метки на 5MeC, нормированной на размер ядра (формула 1). Интенсивность флуоресценции мужского пронуклеуса через 6 ч после копуляции в системе in vitro была принята за 100%. На диаграмме представлены интенсивности флуоресценции в мужском (1, 2) и женском (3,4) пронуклеусе в разное время после копуляции в системах in vivo и in vitro.

Процессы деметилирования ДНК мыши были описаны в нескольких работах (Mayer et al., 2000; Santos et al., 2002; Beaujean et al., 2004c; Young and Beaujean, 2004). Однако время деметилирования мужского пронуклеуса мыши, указываемое разными авторами, различно.

Данный факт можно объяснить тем, что использовались различные методы оплодотворения и отсчёта времени. Так, по данным Майер (Mayer et al., 2000), мужской пронуклеус мыши флуоресценции % Относительная интенсивность сохраняет очень слабое метилирование через 8 ч после оплодотворения. К сожалению, авторы не описывают способ оплодотворения. В исследованиях, предпринятых Сантос (Santos et al., 2002), время деметилирования мужского пронуклеуса варьирует между 3 и 6 ч после микроинъекции спермы. Чтобы уточнить временную динамику деметилирования генома мыши, в диссертационной работе использовали метод датированной беременности для определения момента копуляции. 73 эмбриона мыши было проанализировано через разные промежутки времени после копуляции. Процент эмбрионов с характерным рисунком метилирования изменялся от 75 до 87 % (табл. 10). Первый контакт ооцита и сперматозоида мыши обнаруживался через 2 ч после копуляции. Как видно на рис. 4, А через 3 ч после копуляции можно наблюдать материнский и отцовский пронуклеусы идентично высокометилированные. У 1-клеточного эмбриона через 4 ч после копуляции отцовский пронуклеус существенно больше, чем материнский (рис. 3, С). Через 8 ч после копуляции отцовский пронуклеус окрашен менее интенсивно, чем женский и через 10 ч полностью деметилирован (рис. 3, Е, G). Проанализированы также эмбрионы, развивавшиеся в условиях in vivo и in vitro. Было найдено, что эмбрионы in vitro более метилированы, чем эмбрионы in vivo (рис. 3, I – in vitro, K – in vivo).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»