WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Зайцева Юлия Анатольевна ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ЭНУКЛЕАЦИЯ ООЦИТОВ КРЫС. ПРОЦЕССЫ ДЕМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК У РАННИХ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ КРЫС И МЫШЕЙ 03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Центре молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка (Берлин) и в Институте цитологии Российской акдемии наук (Санкт-Петербург) Научные руководители: кандидат биологических наук Кривохарченко Александр Сергеевич Центр молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка (Берлин) доктор биологических наук, профессор Парфёнов Владимир Николаевич Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Александрова Светлана Алексеевна Институт цитологии РАН доктор медицинских наук, профессор Дыбан Павел Андреевич ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В.Каминская 1

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из форм полового размножения является партеногенез. У некоторых организмов естественный партеногенез — нормальный способ размножения в природе. У других организмов партеногенез вызывается экспериментально действием разных факторов на неоплодотворённую яйцеклетку, причём факторы, активирующие ооцит, в основном видоспецифичны. Лучшим критерием успешной активации ооцитов является способность партеногенетических эмбрионов к предимплантационному и постимплантационному развитию. Как известно, активация ооцита-реципиента является важнейшим этапом клонирования млекопитающих. Ко времени проведения данного исследования попытки получить предимплантационное развитие до стадии бластоцисты у активированных ооцитов крыс оказались неудачными, развитие партеногенетического эмбриона останавливалось на 4-клеточной стадии (Zernicka-Goetz, 1991). На данный момент зафиксирован единичный случай получения клонированной крысы (Zhou et al., 2003);

повторить успех французских учёных пока никому не удалось.

Другой важный этап процедуры клонирования — энуклеация ооцита-реципиента.

Механическая энуклеация обычно сопряжена с высоким повреждающим воздействием.

Альтернативой механической энуклеации может быть химическая энуклеация веществами, надёжно блокирующими генетический материал клетки. Одним из них является этопозид – ингибитор ДНК-топоизомеразы 2, которая ответственна за скручивание и разделение цепей ДНК. Одной из задач работы было изучение возможности применения этопозида для химической энуклеациии ооцитов крыс.

Как известно, метилирование ДНК является эпигенетическим регулятором генной экспрессии (Reik, Dean, 2001). Проблемы культивирования ранних предимплантационных эмбрионов in vitro, низкая эффективность клонирования, сложности партеногенетического развития хорошо коррелируют с ненормальным рисунком метилирования генома.

Отклонения в динамике деметилирования у млекопитающих могут служить маркёром дефектного развития эмбриона. В настоящее время имеются работы по изучению динамики деметилирования генома мыши, однако приводимые в них данные сильно различаются (Mayer et al., 2000; Santos et al., 2002). Для крыс такие данные вообще отсутствуют. Вместе с тем, изучение процессов деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов необходимо для решения как фундаментальных, так и прикладных задач биологии развития.

Цель исследования. Цель работы заключалась в подборе оптимальных параметров активации ооцитов крыс (активирующие агенты, время воздействия) и получении жизнеспособных партеногенетических эмбрионов, в изучении возможности химической энуклеации ооцитов крыс с последующей пересадкой в них ядер соматических клеток и в исследовании динамики деметилирования ДНК зигот (крыса, мышь), развивающихся in vivo и in vitro.

Конкретные задачи исследования 1. Изучить возможность партеногенетической активации ооцитов крысы различными агентами: этиловым спиртом, стронцием, электроимпульсом.

2. Выяснить зависимость эффективности партеногенетической активации от возраста ооцитов крыс.

3. Исследовать способность партеногенетически активированных ооцитов к развитию in vivo и in vitro.

4. Изучить возможность химической энуклеации ооцитов крыс с помощью этопозида.

Сравнить эффективность клонирования при энуклеации химическим и механическим способами.

5. Исследовать динамику деметилирования ДНК у ранних крысиных эмбрионов in vivo и in vitro, сравнить её с динамикой деметилирования у ранних эмбрионов мышей.

6. Оценить уровень метилирования ДНК у партеногенетических и клонированных эмбрионов крысы.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Способность ооцитов крыс к партеногенетической активации существенно варьирует от животного к животному и зависит от времени между инъекцией хорионического гонадотропина человека и моментом извлечения ооцитов.

2. Стронций (Sr+) является более эффективным активатором партеногенеза по сравнению с электроимпульсом и этанолом. Партеногенетические эмбрионы крысы способны развиваться до стадии бластоцисты in vitro и до имплантации in vivo.

3. Этопозид не оказывает влияния на партеногенетическую активацию ооцитов крыс и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие. Доля 2-клеточных эмбрионов после процедуры клонирования практически одинакова как после применения химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации.

4. Деметилированиe ДНК у зигот крыс и мышей происходит с разной скоростью. Эмбрионы обоих видов, культивируемые in vitro, демонстрируют более высокий уровень метилирования по сравнению с развивающимися in vivo. Партеногенетические и клонированные 2-клеточные эмбрионы крысы сохраняют высокий уровень метилирования.

Научная новизна работы. Впервые получены партеногенетические бластоцисты крысы после активации ооцитов этиловым спиртом, стронцием, электроимпульсом, а также после спонтанной активации. Воздействие стронция давало бОльшую долю активированных ооцитов, активировались ооциты всех возрастов. Установлено, что активация ооцитов зависит от промежутка времени между процедурой суперовуляции и выделением ооцитов.

Более старые ооциты крысы активировались успешнее, чем молодые. Впервые показано, что у ооцитов крыс аутбредной линии Wistar имеет место индивидуальная (от крысы к крысе) реакция на партеногенетическую активацию, не зависящая от активирующего агента.

Установлено, что химическая энуклеация ооцитов крысы этопозидом может успешно использоваться при клонировании. Этопозид, являясь специфическим ингибитором фермента ДНК-топоизомеразы 2, не оказывал влияния на партеногенетическую активацию ооцитов и, тем не менее, необратимо блокировал их дальнейшее развитие.

Впервые исследована динамика деметилирования генома крысы на ранних этапах предимплантационного развития. Показано, что эмбрионы крыс и мышей, культивируемые со стадии ранней зиготы до 2-клеточной стадии в системе in vitro имеют более высокий уровень метилирования чем эмбрионы в системе in vivo. Впервые изучен уровень метилирования у партеногенетических эмбрионов крысы вплоть до 4-клеточной стадии развития, а также уровень метилирования у 2-клеточных клонированных эмбрионов.

Обнаружен высокий уровень метилирования в обеих рассматриваемых группах по сравнению с нормальными эмбрионами.

Научно-практическое значение работы. Результаты тестирования различных активирующих агентов показали, что стронций является наиболее эффективным активационным агентом ооцитов крыс, что важно для технологии клонирования. При работе с аутбредной линией Wistar выявлено индивидуальное (от крысы к крысе) варьирование результатов, не зависящее от протокола эксперимента, что необходимо учитывать при проведении эмбриологических работ. Применение химической энуклеации вместо механической может существенно снизить трудоёмкость процесса клонирования крыс и повысить его эффективность. Разный уровень деметилирования мужского пронуклеуса зигот у крыс и мышей в системах in vivo и in vitro может служить индикатором качества используемых культивационных сред, в том числе используемых для манипуляций с эмбрионами человека в программах экстракорпорального оплодотворения. В целом полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии для совершенствовании технологии клонирования млекопитающих, а также при изучении процессов их раннего эмбриогенеза.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены в 3 печатных работах.

Материалы диссертации докладывались на международных конференциях: Scientific Meeting of European Embryo Transfer Association (Rolduc, Niederlande 2002). — Proc. of XVII Working Meeting “Genetic Resource Conservation” (Pushchino, November 19-21, 2003).

Структура и объем диссертации. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы (110 ссылок). Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение и культивирование ооцитов и зигот у мышей и крыс В работе использовали инбредных мышей (CBA х C57BL/6) и аутбредных крыс Wistar и SD.

Суперовуляцию вызывали введением гонадотропных препаратов. Для получения зигот самок подсаживали к самцам той же линии на 1 ч при работе с мышами и на 2 ч при работе с крысами. Это позволило определить время копуляции и проследить хронологию развития эмбрионов. Эмбрионы извлекали в предварительно подогретой среде М2 в разное время после копуляции для исследования в системе in vivo, либо через 2 ч после копуляции у мышей или 3 ч у крыс для исследований в системе in vitro. Кумулюсные клетки отмывали в среде М16, содержащей 0,1 % гиалуронидазы. Эмбрионы культивировали 10 ч в среде М16, а затем в среде mR1ECM (Miyoshi et al., 1997).

Партеногенетическая активация ооцитов крысы Спонтанная активация. Ооциты помещали в предварительно уравновешенную среду М16. В первой группе кумулюсные клетки отмывали немедленно, а во второй спустя 7 - 8 ч.

Активация электроимпульсом. Ооциты 1 - 2 мин уравновешивали в среде, содержащей манитол, затем помещали в камеру для слияния с аналогичной средой. Клетки ориентировали переменным полем, активация индуцировалась при помощи частотного генератора.

Химическая активация. При активации стронцием ооциты инкубировали разное время (мин или 2 ч) в среде М16 без кальция и магния, содержащей 2 мM стронция в инкубаторе при температуре 37 °C и атмосфере, содержащей 5 % углекислого газа. При активации этиловым спиртом ооциты инкубировали в течение 7 мин в среде М16 с 8 % содержанием этилового спирта.

Диплоидизация. Ооциты культивировали 7-8 ч в присутствии цитохалазина Б.

Анализ. Эффективность партеногенетической активации анализировалась через 10 - 12 ч после воздействия активирующего агента. Ооциты оценивали на инвертивном микроскопе с оптикой Номарского. Ооциты с сформировавшимся видимым пронуклеусом считали активированными.

Статистика. Достоверность различия выборочных долей оценивали с помощью критерия 2.

Для сравнения средних величин применялся t-критерий Стьюдента (количественный анализ уровня флуоресценции). Достоверным считался уровень значимости p < 0.05.

Клонирование крысиных эмбрионов Химическая энуклеация. В качестве блокатора генетического материала был использован этопозид (Etoposide, Sigma, США) в концентрации 50 мкг на 1 мл в среде М16. Для растворения этопозида использовали диметилсульфоксид. Ооциты находились в растворе этопозида 1,5; 2,5 или 6 ч. Отмывание проводили в течение 5 мин в 1 М растворе сахарозы.

Механическая энуклеация. При клонировании с использованием механической энуклеации удаление генетического материала производилось с использованием микропипетки. Для этого в область грушевидного выпячивания ооцита на стадии метафазы II вводилась пипетка, метафазная пластина удалялась вместе с частью цитоплазмы. Контролем качества служило окрашивание энуклеированных эмбрионов Хёхстом 33342 и кратковременное (5 с) ультрафиолетовое облучение, что позволило отбраковывать ооциты содержащие собственный генетический материал.

Введение и активация генетического материала. Кумулюсную клетку вводили микропипеткой под блестящую оболочку энуклеированного ооцита. Для слияния цитоплазматических мембран кумулюсной клетки и ооцита использовали камеру для слияния и импульсный генератор (Институт инструментов для биологии, Пущино, Россия).

Активация генетического материала кумулюсной клетки производилась инкубацией в среде со стронцием в течение 15-20 мин.

Иммунофлуоресцентный анализ метилирования Оплодотворённые ооциты отмывали в фосфатном буфере (PBS), фиксировали в 3,7 % растворе формальдегида 10 мин, проницаемость клеточной мембраны повышали инкубацией с Triton X-100 в течение 20 мин при комнатной температуре. Сайты неспецифического связывания антител блокировали обработкой клеток 10 % раствором козьей сыворотки. Для получения иммуннофлуоресцентного окрашивания эмбрионы инкубировали с моноклональными антителами против 5-MeCytosine (Eurogentec), разведёнными 1:150, а также с 7 ед./мл DnaseI (Promega) в 10 %-ном DNase буферном растворе при 37 °C в течение 60 мин. После трёхкратной отмывки в фосфатном буферном растворе клетки инкубировали 60 мин с FITC-связанными вторыми антителами (Dianova) разведёнными 1:300. Ядра клеток окрашивали ДНК-связывающим красителем DAPI (4’, 6-диамидин-2-фенилиндол дигидрохлорид). Слайды заключали в среду Vectashield (Serva).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»