WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Апоптоз, вызванный этопозидом, не сопровождается дегидратацией Плавучая плотность клеток при апоптозе, вызванном этопозидом. Инкубация клеток в течение 4 ч с этопозидом в концентрации 50 мкМ не приводила к увеличению их плавучей плотности (рис.1, табл. 1), несмотря на признаки апоптоза, о которых речь пойдет ниже. Иногда верхняя граница зоны, занимаемой клетками в градиенте, оказывалась даже выше, чем в контроле. В некоторых опытах наблюдалось небольшое уменьшение плавучей плотности после 2-часовой инкубации, когда ни микроскопия, ни цитометрия не позволяли еще заметить признаки апоптоза. Инкубация клеток в течение1824 ч при концентрации этопозида 0.84 мкМ, сопровождающаяся изменением ДНК-гистограммы, также не приводила к появлению клеток с увеличенной плавучей плотностью.

Ионный состав клеток при апоптозе, вызванном этопозидом. При апоптозе клеток U937, вызванном этопозидом, содержание K+ снижалось меньше, чем при действии стауроспорина (табл.1). Увеличение содержания Na+ компенсировало уменьшение содержания K+, и суммарное содержание K+ и Na+ практически не изменялось. Это хорошо согласуется с отсутствием дегидратации клеток при действии этопозида. Концентрация K+ во внутриклеточной воде при действии этопозида снижалась на 12%, а концентрация Na+ увеличи- валась на 29%. Необходимо отметить, что при апоптозе клеток U937, вызванном этопозидом, несмотря на отсутствие дегидратации и изменения суммарного содержания K+ и Na+, а также содержания Cl-, отношение K+/Na+ снижалось (табл. 1, рис. 7, 9), что свидетельствует о переcтройке ионного баланса и изменении работы основных трактов переноса ионов через плазматическую мембрану.

Рис. 7. Потоки Rb+ через насос и каналы (мкмоль/г белка за 10 мин) и внутриклеточное содержание K+, Na+ и Cl- (ммоль/г белка) в контроле (светлые столбики) и при 45 часовом апоптозе, вызванном этопозидом мкM или стауроспорином 0.2 мкM (темные столбики) Клетки U937-160B2. Опыты 2007 г.

Рис. 8. Отношение потока Rb+ через насос и Рис. 9. Изменение отношения K+/Na+ при апоптозе каналы при апоптозе, вызванном этопози- вызванном этопозидом, в отдельных опытах.

дом, к потоку в контроле в отдельных опы- Отношение K+/Na+ у контрольных клеток приня- тах. Клетки U937-160B2. Опыты 2008 г. то за 100 %. Клетки U937-160B2. Опыты 2008 г.

Для того чтобы идентифицировать эти тракты, измеряли уабаин-чувствительный и уабаин-резистентный потоки Rb+. При апоптозе клеток U937-160B2, вызванном 50 мкM этопозидом, уабаин-чувствительный поток Rb+ снижался в среднем на 4354 % в зависимости от серии опытов, а уабаин-резистентный поток возрастал на 3037% (рис.7, 8). Это означает, что ионные изменения при апоптозе этих клеток вызваны и деградацией насоса, и открыванием K+ каналов. Аналогичные изменения происходили и при апоптозе клеток линии U937N9957.

Микроскопия и проточная цитометрия при апоптозе, вызванном этопозидом. У клеток U937, инкубированных 4 ч с этопозидом в концентрации 50 мкМ, наблюдался комплекс изменений, характерных для апоптоза. К их числу относится образование апоптозных тел (рис. 4, г). На диаграммах, полученных проточной цитометрией препаратов, окрашенных АО, после 4-часового действия этопозида возрастало количество мелких частиц (рис. 6, б, IIIV), отражающее увеличение количества апоптозных телец. Количество этих частиц по отношению к числу целых клеток после 4- часового действия этопозида составляло, в среднем, 45.0 + 5.8 % (n = 9), тогда как у контрольных препаратов оно не превосходило 7.5 + 0.%. Отметим, что на аналогичных диаграммах, полученных при действии на клетки STS, области, соответствующей апоптозным тельцам, нет, а пик Fr на ДНК гистограммах отражает количество ядерных фрагментов, освобождающихся при обработке клеток детергентом (сравни рис. 6, а, III-IV и б, III-IV).

На ДНК-гистограммах, полученных для клеток, инкубированных с этопозидом 4 ч, значительно уменьшалась доля клеток в S-фазе и увеличивалось количество ядерных фрагментов, хотя субдиплоидный пик не выделялся (рис. 6, б, I, табл. 2). Изменение количества апоптозных телец от опыта к опыту хорошо коррелировало с количеством S-фазных клеток в контроле (R = 0.92, P < 0.001). После 2-х часовой инкубации клеток с этопозидом изменений, подобных описанным выше, мы не наблюдали.

Уменьшение доли S-фазных клеток в опытах с этопозидом хорошо согласуется с данными других исследователей, указывающими на то, что при действии этопозида и других ингибиторов топоизомеразы 2 в течение 3-6 ч апоптозу подвергаются клетки, проходящие Sфазу (Barry et al., 1993; Kataoka et al., 1994; Endresen et al., 1995; Gorczyca et al., 1993; Than et al., 2001). Это связано, по-видимому, с тем, что именно при репликации проявляется жесткость комплекса топоизомеразы 2 с этопозидом, которая приводит к повреждению ДНК (Hande, 1998).

В ряде опытов с градиента снимали отдельно верхнюю, более легкую, и нижнюю, более тяжелую, часть клеточной популяции и проводили их раздельный анализ. Такие опыты показали, что апоптозных телец и мелких ядерных фрагментов на гистограммах, соответствующих легкой зоне, обычно меньше, чем в случае тяжелой. По ДНК-гистограммам количество мелких ядерных фрагментов в легкой зоне было всегда меньше, чем тяжелой, и их отношение в среднем по 6 опытам составило 0.46 ± 0.06.

Действие этопозида в рассматриваемых условиях сопровождалось хорошо выраженной конденсацией хроматина. Характер конденсации при этом существенно отличался от наблюдаемого при действии STS. При действии этопозида у значительной части клеток хроматин группировался в виде небольшого числа шарообразных тел. Особенно хорошо это было видно при использовании сканирующего конфокального микроскопа (рис. 4, в). При проточной цитометрии нативных клеток фрагменты хроматина, находящиеся в одной клетке, дают общий сигнал, величина которого близка к той, что дают нативные клетки с нефрагментиро ванным ядром. Для анализа ДНК-гистограмм клетки по стандартной методике обрабатываются детергентом, клеточная мембрана разрушается, рассматриваемые тела разъединяются и далее регистрируются уже как отдельные частицы. Наряду с клетками, содержащими хроматин в виде группы относительно крупных шаров близкого размера популяция клеток, инкубированных с этопозидом, содержала клетки, от которых отпочковывались небольшие круглые апоптозные тельца, тоже содержащие хроматин. Микроскопия клеток, окрашенных RH414 в комбинации с ДНК-тропными красителями АО или Hoechst 33342, показала, что степень заполнения хроматином апоптозного «пузырька» с мембраной, окрашенной RH414, может быть очень разной (рис. 4, г).

В целом, наблюдавшиеся нами морфологические изменения у клеток U937 соответствуют изменениям, описанным для этой модели апоптоза другими исследователями, изучавшими кроме морфологических изменений также и весь комплекс биохимических маркеров апоптоза (Ghibelli et al., 1995; Garcia-Bermejo et al., 1998; Martinsson et al., 2001; Umeda et al., 2001). Это позволяет заключить, что у исследованных нами клеток при действии этопозида развивался типичный апоптоз, который мог бы считаться «классическим», если бы имело место и снижение внутриклеточного содержания воды. Таким образом, совокупность полученных данных приводит к выводу, что апоптоз может быть и без уменьшения удельного содержания в клетках воды.

В свете полученных нами результатов обязательным признаком апоптоза, отличающим его от некроза, следует считать не клеточное сжатие, а отсутствие набухания вследствие сохранения достаточно низкого уровня проницаемости клеточной мембраны для таких важных клеточных осмолитов, как калий и натрий (Vereninov et al., 2007). Именно по этой причине при апоптозе нет осмотического лизиса, которым всегда сопровождается клеточный некроз.

ВЫВОДЫ 1. Апоптоз клеток U937, вызванный стауроспорином, сопровождается дегидратацией на 2/за счет изменения содержания K+ и Сl-. Изменение концентрации K+ во внутриклеточной воде при этом невелико и не может играть существенную роль в развитии апоптоза.

2. Ионные изменения при слабом апоптозе, вызванном стауроспорином, у сублинии U937160B2 связаны, преимущественно, с увеличением потока Rb+(K+) через каналы, а у сублинии U937-N9957 – только с уменьшением потока Rb+(K+) через насос.

3. Ионные изменения при сильном апоптозе, вызванном стауроспорином, у сублинии U937160B2 связаны, преимущественно, с уменьшением потока Rb+(K+) через насос.

4. Апоптоз, вызванный у клеток U937 этопозидом, в отличие от апоптоза, вызванного стауроспорином, не сопровождается дегидратацией и тем не менее сопровождается изменением ионного баланса – уменьшением отношения K+/Na+ без уменьшения суммарного содержания K+, Na+ и Cl-, уменьшением потока Rb+(K+) через насос и увеличением потока Rb+(K+) через каналы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Веренинов А.А, Волгарева Е. В., Матвеев В. В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Водный и ионный баланс тимоцитов крысы при апоптозе, вызванном декcаметазоном и этопозидом. Ионо-осмотическая модель уменьшения объема клетки. Цитология. 45(5) : 500-509.

2. Веренинов А.А., Горячая Т.С., Матвеев В.В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Сакута Г.А., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2004. Дегидратационное сокращение объема клеток при апоптозе – факультативный признак. Цитология. 46(7) : 609-619.

3. Yurinskaya V., Goryachaya T., Guzhova I., Moshkov A., Rozanov Y., Sakuta G., Shirokova A., Shumilina E., Vassilieva I., Lang F., Vereninov A.. 2005. Potassium and sodium balance in Ucells during apoptosis with and without cell shrinkage. Cell Physiology and Biochemistry.16 : 155162.

4. Yurinskaya V.E., Moshkov A.V., Rozanov Y.M., Shirokova A.V., Vassilieva I.O., Shumilina E.

V., Lang F., Volgareva E. V., Vereninov A. A. 2005. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cell Physiology and Biochemistry 16 : 15-22.

5. Широкова А.В. 2007. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и водного баланса клетки. Цитология 49(5) : 385-394.

[Shirokova A.V. 2007. Apoptosis. Signaling pathways and cell ion and water balance. Cell and Tissue Biology 1 : 215-224].

6. Веренинов А.А., Горячая Т.С., Матвеев В.В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Сакута Г.А., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Уменьшение объема клеток и потеря воды как определяющий признак апоптоза. Цитология 45 (9) : 857. (Тезисы докладов и сообщений, представленных на 1-й всероссийский съезд Общества клеточной биологии).

7. Мошков А.В., Васильева И.О., Веренинов А.А., Матвеев В.В., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Механизмы сжатия клеток при апоптозе. Сб. “Итоги исследований по программам СПб НЦ РАН 2001-2003 г.г.” - Наука, СПб. 66-67.

8. Веренинов A.A., Горячая Т.С., Розанов Ю.М., Широкова А.В., Юринская В.Е., Ланг Ф., Рубашкин A.A. 2007. Баланс потоков К+, Na+ и C1- через плазматическую мембрану у клеток лимфомы человека U937 в норме и при апоптозе, ионные механизмы апоптозной дегидратации клеток. Цитология 49(9) : 726. (Тезисы докладов и сообщений, представленных на 2-й всероссийский съезд Общества клеточной биологии).

9. Vereninov A.A., Rubashkin A.A., Goryachaya T.S., Moshkov A.V., Rozanov Yu.M., Shirokova A.V.., Strelkova E.G., Lang F., Yurinskaya V.E. 2008. Pump and channel K+ (Rb+) fluxes in apoptosis of human lymphoid cell line U937. Cellular Physiology and Biochemistry 22 : 187-194.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Веренинов А. А., Волгарева Е. В., Матвеев В. В., Мошков А. В., Розанов Ю. М., Широкова А. В., Юринская В. Е. 2003. Водный и ионный баланс тимоцитов крысы при апоптозе, вызванном декcаметазоном и этопозидом. Ионо-осмотическая модель уменьшения объема клетки. Цитология. 45(5) : 500-509.

Лонская И.А., Волгарева Е.В., Розанов Ю.М. [Lonskaya,I. A., Volgareva E. V., Rozanov Y. M.] 2001. Two different types of apoptosis in thymocytes. Цитология. 43(3) : 244-249.

Розанов Ю. М. 1988. Проточная цитометрия. В кн.: Методы культивирования клеток. Л.:

Наука. 136-146.

Розанов Ю. М., Барский И. Я., Папаян Г. В., Платунов С. Е., Забродин А. С. 1990. Многопараметрический цитометр-анализатор на базе микроскопа «ЛЮМАМ». В кн.: Автоматизация цитологических исследований. Киев: Наук. думка. 136-139.

Akimova O.A., Poirier M., Kotelevtsev S.V., Hamet P., Orlov S.N. 2008.The death of ouabaintreated renal epithelial cells: evidence against anoikis occurrence.Apoptosis.13(5) : 670-80.

Barry M. A., Reynolds J. E., Eastman A. 1993. Etoposide-induced apoptosis in human HL-60 cells is associated with intracellular acidification. Cancer Res. 53 : 2349-2357.

Beauvais F., Michel L., Dubertret L. 1995. Human eosinophils in culture undergo a striking and rapid shrinkage during apoptosis. Role of K+ channels. J. Leukoc. Biol. 57 : 851-855.

Blanco G., Nguyen A.-N. 2008. Ouabain stimulates both proliferation and apoptosis in renal epithelial cells from patients with autosomal dominant polycystic kidney disease. FASEB J, 22 :

1157.6.

Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2002. Apoptotic volume decrease and the incredible shrinkingcell.

Cell Death. Differ. 9 : 1307-1310.

Bortner C. D., Gmez-Angelats M., Cidlowski J. A. 2001. Plasma membrane depolarization without repolarization is an early molecular event in anti-Fas-induced apoptosis. J. Biol. Chem. : 4304-4314.

Bortner C. D., Sifre M. I., Cidlowski J. A. 2008. Cationic gradient reversal and cytoskeletonindependent volume regulatory pathways define an early stage of apoptosis. J. Biol. Chem., 283 :

7219 - 7229.

Dssmann H., Rehm M., Kgel D., Prehn J. H. 2003. Outer mitochondrial membrane permeabilization during apoptosis triggers caspase-independent mitochondrial and caspasedependent plasma membrane potential depolarization: a single-cell analysis. J. Cell Sci. 116 : 525536.

Elliott J. I., Higgins C. F. 2003. IKCa1 activity is required for cell shrinkage, phosphatidylserine translocation and death in T lymphocyte apoptosis. EMBO Rep. 4 : 189-194.

Elmore S. 2007. Apoptosis: а review of programmed cell death. Toxicologic Pathology 35 : 495-516.

Endresen P. C., Prytz P. S., Aarbakke J. 1995. A new flow cytometric method for discrimination of apoptotic cells and detection of their cell cycle specificity through staining of F-actin and DNA.

Cytometry 20 : 162-Ernest N. J., Habela C W., Sontheimer H. 2008. Cytoplasmic condensation is both necessary and sufficient to induce apoptotic cell death. J. Cell Sci., 121: 290-297.

Falcieri E., Martelli A.M., Bareggi R., Cataldi A., Cocco L. 1993. The protein kinase inhibitor staurosporine induces morphological changes typical of apoptosis in MOLT-4 cells without concomitant DNA fragmentation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193 : 19-25.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»