WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Плавучая плотность клеток при апоптозе, вызванном стауроспорином. Характерная картина распределения клеток U937 в непрерывном градиенте Перколла в норме и при действии на них стауроспорина (STS) и этопозида (Eto) представлена на рис. 1. При действии на клетки STS вся популяция смещается в градиенте в сторону высокой плотности. В среднем плавучая плотность клеток, инкубированных в среде с 1 мкМ STS в течение 4 ч, возрастала с 1.040-1.046 до 1.049-1.060 г/мл (табл. 1). Зона, занимаемая клетками в градиенте, составляла при этом 0.011 ± 0.001 г/мл (n = 10), то есть несколько расширя Рис. 1. Распределение клеток в градиенте плотности Перколла после 4 ч инкубации со стауроспорином (STS, 1 мкМ) или этопозидом (Eto, 50 мкМ). Клетки U937-160B2.

лась по сравнению с контрольными клетками, у которых она равнялась 0.006 ± 0.001 г/мл (n = 16). В каждом отдельном опыте полоса смещалась обычно так, что нижняя граница у контрольных клеток располагалась выше верхней границы у клеток, инкубированных с STS (рис. 1). Действие STS не приводило к возникновению в плотностном градиенте двух полос, как это мы наблюдали в аналогичных условиях при апоптозе тимоцитов, вызванном этопозидом или дексаметазоном (Веренинов и др., 2003).

Плавучая плотность клеток определяется, главным образом, соотношением содержания в клетке воды, белка и нуклеиновых кислот. Увеличение плотности клеток при действии STS связано с уменьшением удельного содержания воды. Наши данные позволяют количественно определить соотношение между клеточной дегидратацией и уменьшением суммарного содержания основных внутриклеточных осмолитов. Расчет показывает, что наблюдавшееся в опыте увеличение плотности клеток после 4-х часовой инкубации с 1 мкМ STS соответствует уменьшению содержания внутриклеточной воды в среднем на 25 %. Следует отметить, что оценка относительного изменения содержания воды практически не зависит от принятого при расчете значения средней плотности сухой массы клетки.

Ионный состав клеток при апоптозе, вызванном стауроспорином. По сравнению с контрольными клетками внутриклеточное содержание K+ в апоптозной популяции клеток U937 c уменьшенным объемом снижалось в среднем на 29% (табл.1). Внутриклеточное содержание Na+ увеличивалось на 13%. Суммарное содержание K+ и Na+ при действии STS снижалось на 20%. Эта величина близка к относительному изменению содержания воды (в среднем на 25 %). В более поздней серии опытов определяли одновременно содержание K+, Na+ и Cl-. При суммарном снижении содержания K+ и Na+ на 0.101 мэквив/г белка снижение содержания Cl- составляло 0.096 мэквив/г белка, то есть было близким к общему снижению содержания K+ и Na+.

Т а б л и ц а Внутриклеточное содержание воды, K+ и Na+ в норме и при апоптозе, вызванном 1 мкМ стауроспорином (STS) и 50 мкМ этопозидом (Eto). Клетки U937-160B2.

Плавучая плот- Вода, K+ Na+ [K+] [Na+] K+/ Na+ Клетки ность, мл/г ммоль/ ммоль/ мМ мМ г/мл белка г белка г белка Контроль к STS 1.04-1.046 (16) 6.7 1.1±0.03 0.30±0.02 164 45 3.9±0.2 (35) STS, 1 мкМ, 4 ч 1.049-1.06 (10) 5.0 0.78±0.03 0.34±0.02 156 68 2.7±0.2 (25) Контроль к Eto 1.037-1.045 (7) 7.1 1.16±0.04 0.27±0.01 163 38 4.4±0.2 (20) Eto, 50мкМ, 4 ч 1.036-1.045 (7) 7.1 1.02±0.03 0.35±0.02 143 49 3.0±0.2 (19) Принципиальным является вопрос, в какой мере апоптозная дегидратация клеток обусловлена выходом из клетки K+, Na+ и Cl- и в какой - выходом иных внутриклеточных осмолитов. По известному содержанию в клетке воды, K+, Na+, Cl- можно вычислить содержание “непроникающих“ внутриклеточных осмолитов и их средний электрический заряд. У клеток без жесткой оболочки внутриклеточная осмотическая активность должна равняться общей активности среды, которую можно принять равной 310 мосмоль/л. При содержании воды в клетках 5.52 мл/г белка общая осмотическая активность внутриклеточных осмолитов должна быть равна 1.71 мосмоль/г белка, из которых на K+, Na+ и Cl- приходится 1.мосмоль/г белка, т.е. около 67 % общей внутриклеточной осмотической активности. Относительное изменение суммарного содержания K+, Na+ и Cl- при апоптозе в 2 -2.5 раза превосходит изменение содержания остальных внутриклеточных осмолитов. Отсюда следует, что в апоптозной дегидратации в исследованном нами случае решающее значение имеет выход K+ и Cl-. Cредний заряд “остальных” осмолитов у апоптозных клеток остается близким к заряду у нормальных клеток.

Ряд исследователей считает, что изменение внутриклеточной концентрации K+ при апоптозе изменяет состояние каспаз и нуклеаз (Hughes et al., 1997; Hughes, Cidlowski, 1999).

В наших опытах внутриклеточная концентрация K+ при действии STS снижалась всего лишь на 5% (табл.1). Вряд ли столь незначительное изменение внутриклеточной концентрации K+ может оказывать существенное влияние на состояние каспаз. Уменьшение концентрации K+ в расчете на воду, сопровождающееся снижением суммарной концентрации K+ и Na+, о котором говорится в работах c использованием флуоресцентных зондов (McCarthy, Cotter, 1997), свидетельствует о набухании клеток, а набухание клеток – это признак некроза, а не апоптоза (Kerr, 1971). Внутриклеточная концентрации Na+ увеличивалась при апоптозе у ис- следованных нами клеток примерно в 1.5 раза и это могло бы быть более существенным фактором по сравнению с изменениями концентрации K+.

Поскольку при апотозе клеток U937, вызванном 1 мкМ STS, были выявлены изменения ионного баланса, необходимо было выяснить, какие тракты участвуют в этом процессе. По вопросу о том, какой транспорт играет главную роль в изменении ионного баланса при апоптозе, насос или K+ каналы, в литературе высказываются различные мнения.

Некоторые исследователи сообщают о снижении активности, либо о деградации субъединиц Na+,K+-АТФазы при апоптозе (Nobel et al., 2000; Mann et al., 2001; Bortner et al., 2001; Dssmann et al., 2003; Blanco, Nguyen 2008). Другая группа исследователей считает, что ведущую роль при апоптозном изменении ионного баланса играют K+ каналы (Beauvais et al.,1995;

Maeno et al., 2000; Elliot, Higgins, 2003). Мы обнаружили, что механизмы могут быть разными в зависимости от глубины или степени апоптоза и вида клеток. На сублиниях клеток U937-160B2 и U937-N9957 были исследованы изменения баланса потоков главных однозарядных ионов при неглубоком апоптозе, вызываемом стауроспорином (0.2 мкМ, 45 ч).

Установлено, что при таком апоптозе относительно небольшое уменьшение внутриклеточного содержания воды (на 1013 %) у клеток U937-160B2 обусловлено увеличением интегральной проницаемости K+ каналов (в 1.41.5 раза) при неизменяющейся активности Na+/K+ насоса (рис. 2, 7).

Рис. 2. Потоки Rb+ через насос и каналы (мкмоль на г белка за 10 мин) и внутриклеточное содержание K+, Na+ и Cl- (ммоль на г белка) в контро- ле (светлые столбики) и при 5-ти часовом апоптозе, вызванном 0.2 мкM стауроспорином (темные столбики) у клеток U937-160B2 и U937-N9957.

У клеток U937-N9957 при такой же дегидратации в строго аналогичных условиях имеет место снижение потоков K+ и Na+ через насос (в 1.6 раза), которое не приводит к набуханию клеток из-за того, что параллельно уменьшается интегральная проницаемость Na+ каналов (в 1.82.3 раза). Это означает, что при слабом апоптозе клеток U937-160B2 основную роль в изменении ионного баланса играют K+ каналы, а при слабом апоптозе клеток U937-N9957 - насос. Столь различное поведение этих сублиний при действии стауроспорина наблюдалась только в случае слабого апоптоза, вызванного 0.2 мкM стауроспорином, когда наблюдалась 1013 %-ная дегидратация. На обеих сублиниях при действии стауроспорина суммарное содержание K+ и Na+ уменьшалось. Содержание Cl- также уменьшалось на величину, эквивалентную убыли катионов.

Снижение активности насоса наблюдалось у обеих линий при более глубоком апоптозе, вызванном 1 мкM стауроспорином и сопровождающемся 18 %-ной дегидратацией.

Уабаин-резистентный поток Rb+, основную часть которого составляет поток через K+ каналы, при этом изменяется незначительно. В изменении ионного баланса в этом случае главную роль играет насос (рис. 3).

Рис. 3. Потоки Rb+ через насос и каналы ( мкмоль/г белка за мин) в контроле (светлые столбики) и при 5-ти часовом апоптозе клеток U937-160B2, вызванном стауроспорином 0.2 мкM и 1 мкM (темные столбики). Клетки U937-160BМикроскопия и проточная цитометрия. Инкубация клеток с STS в течение 4 ч приводила к исчезновению ядрышек, хорошо видимых при окрашивании клеток АО в контроле, и харак- Рис. 4. Морфология клеток U937 после 4-х часовой инкубации с 1 мкМ STS (б) и 50 мкМ этопозидом (в, г). а – контрольные клетки; г – примеры апоптозных телец, образующихся при инкубации клеток с этопозидом (выборка, передающая частоту встречаемости отдельных типов телец). а, б, г – окраска АО в сочетании с RH414, в – окраска только АО. Клетки U937-160B2.

терной конденсации хроматина с образованием как бы «полой» сферы (рис. 4, а, б). Экваториальное сечение таких клеток имеет вид кольца. На поздних стадиях образуются серповидные структуры. Конденсация хроматина при апоптозе, вызванном STS, которую мы наблюдали на окрашенных АО живых клетках U937, в частности, образование серповидных хроматиновых структур, сходна с тем, что наблюдали другие авторы, изучавшие вызванный STS апоптоз различных клеток миелоидного и лимфоидного ряда с помощью электронной и световой микроскопии после фиксации (Falcieri et al., 1993; Sakahira et al., 1999; Johnson et al., 2000; Maeno et al., 2000). Действие STS проявлялось не только в конденсации хроматина, но и в изменении формы клеток: они округлялись, и их поверхность становилась более «гладкой». Особенно заметно это было при микроскопии в проходящем свете при опущенном конденсоре, когда клетки выглядели как блестящие шарики, и при флуоресцентной микроскопии клеток, окрашенных RH414. После 2-часовой инкубации клеток с STS описанные морфологические изменения можно было наблюдать у относительно немногих, а после 4-х часовой – у большинства клеток. Плавучая плотность клеток, как правило, возрастала уже после 2-х часовой инкубации с STS.

Морфометрический анализ показал, что распределение клеток по размеру как в контроле, так и при действии STS, близко к нормальному (рис.5). Диаметр клеток после инкубации с STS 24 ч в среднем по 5 опытам, в которых проводился морфометрический анализ, был на 10 % меньше, чем в контроле. Во всех случаях различия были статистически достоверны.

Структуры, прокрашиваемые АО вне ядра – гранулы оранжевого или, реже, зеленого цвета, – при действии STS выглядели так же, как и в контроле, и располагались преимущественно по периферии клетки. Как и у контрольных клеток, в этом Рис. 5. Распределение по размерам случае наблюдалась диффузная зеленая флуоресценклеток, инкубированных с ция АО в цитоплазме. Поскольку суммарная флуомкМ STS.Клетки U937-160B2.

ресценция живой клетки, окрашенной АО, определяется связыванием этого красителя не только с ДНК, но и с другими субстратами, гистограмма, полученная проточной цитометрией нативных клеток в зеленой области спектра (рис. 6, а, III, «Green Histogram»), отличается от обычной ДНК-гистограммы, полученной после обработки клеток детергентом и окрашивания ядер и их фрагментов БЭ (6 а, I, «DNA Histogram»). По той же причине не совпадают Рис. 6. Проточная цитометрия клеток в норме и при апоптозе, вызванном 1мкМ STS (а) и 50 мкМ этопозидом (б). Клетки U937-160B2.

гистограммы, полученные на одних и тех же клетках в зеленой (рис. 6, а, III, «Green Histogram») и красной спектральных областях (рис. 6, а, IV, “Red Histogram”). Природа субстратов, связывающих АО в цитоплазме, у разных клеток может быть различной, и идентифицировать ее непросто (Zelenin, 1999). Как бы то ни было, изменение двумерной диаграммы распределения флуоресценции нативных клеток, окрашенных АО, в красном и зеленом каналах (Red/Green) хорошо отражает переход клеток к апоптозу (Лонская и др., 2001). Мы наблюдали изменение такой диаграммы при апоптозе тимоцитов (Веренинов и др., 2003) и при действии на клетки U937 этопозида (Рис. 6, б, II). При действии STS на клетки U937 изменение двумерной диаграммы Red/Green наблюдалось не во всех опытах и было менее выражено, чем в других, исследованных, нами случаях апоптоза. В опыте, результаты которого приведены на рис.6, а, появлялась субпопуляция клеток, у которых «красная» флуоресценция АО по отношению к «зеленой» усиливалась. Количество таких клеток составляло примерно треть популяции.

Краситель RH414 у клеток U937, как правило, концентрировался в области плазматической мембраны. У некоторых клеток этот краситель интенсивно прокрашивал и цитоплазму. Количество таких клеток варьировало от опыта к опыту обычно в пределах 1012 % и коррелировало с количеством клеток, прокрашивавшихся БЭ. При действии STS количество клеток, интенсивно окрашивающихся RH414 и БЭ, не возрастало и даже несколько уменьшалось. Прокрашивание клеток БЭ принято считать признаком поздних стадий апоптоза, когда плазматическая мембрана становится проницаемой для БЭ и образуются комплексы БЭ с ДНК. Долю клеток, прокрашивающихся БЭ, часто используют как меру апоптоза в популяции. Судя по этому признаку мы имели дело с “ранним” апоптозом. С чем связано сплошное прокрашивание клеток RH414, пока неясно.

Анализ ДНК-гистограмм, полученных проточной цитометрией ядер и ядерных фрагментов, показал, что соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, если и изменяется после действия STS, то незначительно (рис. 6, а). При апоптозе, вызванном стауроспорином, средние значения отношения S/G1 не отличаются от контрольных (табл.2). Независимость индукции апоптоза STS от фазы клеточного цикла недавно была по казана на синхронизированной культуре клеток Jurkat (Than et al., 2001). Субдиплоидный пик на ДНК-гистограммах при действии STS на клетки U937 обычно отсутствовал, но появлялось много ядерных фрагментов. Отметим, что при апоптозе тимоцитов крысы, вызванном STS, субдиплоидный пик на аналогичных ДНК-гистограммах был всегда хорошо выражен (Веренинов и др., 2003). Несмотря на большое количество ядерных фрагментов на ДНКгистограммах получаемых после фиксации препаратов микроскопирование нативных клеток при действии STS не выявляло нарастания числа клеточных фрагментов, соответствую- Клетки S/G1 G2/G1 Fr % n Т а б л и ц а Распределение клеток по фазам кле- Контроль 0.74±0.06 0.13±0.01 5.8±0.9 точного цикла при апоптозе, выз- STS 0.76±0.1 0.19±0.03 34.7±5.6 ванном STS (1 мкМ, 4 ч) и этопозидом Контроль 0.77±0.06 0.14±0.01 5±0.5 (50 мкМ, 4 ч). Клетки U937-160B2.

0.32±0.02 0.08±0.01 26.5±3.8 Этопозид ющих апоптозным тельцам (рис. 6, а). Причина здесь, очевидно, в том, что при действии STS ядерные фрагменты остаются в клетке и освобождаются только при действии детергента в процессе приготовления препарата для проточной флуорометрии ДНК.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»