WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ШИРОКОВА Анна Вячеславовна ИЗМЕНЕНИЕ ВОДНОГО И ИОННОГО БАЛАНСА КЛЕТОК U937 ПРИ АПОПТОЗЕ, ВЫЗВАННОМ ЭТОПОЗИДОМ И СТАУРОСПОРИНОМ 03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2008

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный консультант: доктор биологических наук Веренинов Алексей Андреевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Марахова Ирина Ильинична Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук Савина Маргарита Васильевна Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится 28 ноября 2008 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан 23 октября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В.Каминская 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Апоптоз – программируемая гибель клеток, естественный процесс, предназначенный для элиминации поврежденных клеток, либо клеток, “не нужных” по программе индивидуального развития организма. Неспособность клеток подвергаться апоптозу одна из причин развития злокачественных опухолей. Апоптоз может быть вызван как эндогенными, так и экзогенными факторами и отличается от некроза по ряду признаков.

Важнейшим из них в функциональном плане является отсутствие воспалительной реакции соседних клеток на продукты распада благодаря длительному сохранению целостности плазматической мембраны. Характерные признаки апоптоза: утрата межклеточных контактов, блеббинг, дегидратационное сжатие клеток, разрушение цитоскелета, конденсация хроматина, фрагментация ядер, деградация ДНК (Hcker, 2000; Bortner, Cidlowski, 2002; Elmore, 2007).

Сокращение объема клеток исторически рассматривалось как главный признак апоптоза, отличающий его от некроза (Kerr, 1971). Заключение об уменьшении объема клеток ранее делали на основании микроскопии фиксированных гистологических препаратов. В настоящее время апоптоз изучают во многих случаях на живых клетках, и вывод о сокращении размеров клеток обычно основан на измерениях малоуглового светорассеяния при проточной цитометрии, хотя этот метод нельзя считать строгим (Shapiro, 1988). Апоптозное уменьшение объема клеток (Apoptotic Volume Decrease, AVD) связывают с их дегидратацией (Okada et al., 2001; Ernest et al., 2008). Интерес к исследованию роли моновалентных ионов в апоптозе в последние годы не ослабевает (Lang et al., 2005; 2006; 2007; 2008; Akimova et al., 2008; Numata et al., 2008). Широко распространено представление, что выход внутриклеточного K+ является важным процессом, сопровождающим, а по мнению многих исследователей и обуславливающим AVD (Bortner, Cidlowski, 2002; Park, Kim, 2002; Yu, 2003a; Bortner et al., 2008). Ряд исследователей считает, что изменение внутриклеточной концентрации K+ при апоптозе изменяет состояние каспаз и нуклеаз (Hughes et al., 1997; Hughes, Cidlowski, 1999).

Тем не менее, работ, в которых ионный и водный баланс клеток при апоптозе измеряли бы параллельно, мало, и остается неясным, как изменение содержания K+ в клетках соотносится с изменением содержания внутриклеточной воды и, соответственно, с изменением концентрации K+ во внутриклеточной воде. Представлялось актуальным исследовать этот вопрос, используя наиболее чувствительный в настоящее время метод определения внутриклеточного содержания воды путем измерения плавучей плотности клеток в градиенте Перколла и технику эксперимента, позволяющую анализировать содержание ионов в отдельных плотностных фракциях. Такой подход ранее не применялся.

Актуальным представлялось также исследование изменений баланса моновалентных ионов при апоптозе, не сопровождающемся дегидратацией, то есть таком, который наблюдается у клеток U937, при действии этопозида. Предполагалось, что изучение изменений ионного баланса, не связанных с нарушением водного баланса, даст более широкую картину участия в апоптозе основных систем переноса моновалентных ионов через клеточную мембрану.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы - сравнительное исследование изменения ионного и водного баланса клеток U937 при апоптозе, вызванном стауроспорином, когда по предварительным наблюдениям имеет место дегидратация клеток, и при апоптозе, вызванном этопозидом, когда водный баланс не изменяется. В связи с поставленной целью необходимо было провести следующие исследования:

1. Путем измерения плавучей плотности клеток U937 определить наличие или отсутствие дегидратации при апоптозе, вызванном стауроспорином и этопозидом.

2. С помощью эмиссионного и радиоизотопного анализа определить внутриклеточное содержание K+, Na+ и Cl- и измерить потоки Rb+ через клеточную мембрану клеток U937 при апоптозе, вызванном стауроспорином и этопозидом.

3. Для диагностики апоптоза провести проточную цитометрию и флуоресцентную микроскопию клеток.

Научная новизна работы. Впервые показано, что вызванный этопозидом апоптоз клеток U937 не сопровождается дегидратацией и уменьшением объема клеток. Впервые показано, что и при отсутствии апоптозной дегидратации в клетках имеют место ионные изменения – снижение соотношения содержания внутриклеточных катионов K+ и Na+ и изменение потоков Rb+(K+) через плазматическую мембрану. В случае апоптоза, вызванного этопозидом, изменения ионного баланса обусловлены как снижением направленного в клетку потока калия через Na+/K+ насос, так и нарастанием потока калия из клетки вследствие увеличения интегральной проницаемости калиевых каналов. Впервые показано, что при апоптозе, вызванном стауроспорином, дегидратация клеток и изменение ионного баланса в зависимости от глубины апоптоза и клеточной сублинии могут быть связаны преимущественно с уменьшением потока катионов через Na+/K+ насос, как это происходит у клеток U937-N9957, но могут быть связаны и с увеличением уабаин-резистентного потока Rb+(K+) (потока через каналы) без существенного изменения потока через насос, как это имеет место у клеток U937160B2. Благодаря одновременному определению содержания в клетках воды, K+, Na+ и Сl- впервые на примере апоптоза клеток U937, вызванного стауроспорином, строго показано, что апоптозная дегидратация клеток определяется главным образом (на 2/3) снижением внутриклеточного содержания K+ и Сl-, и что концентрации K+ во внутриклеточной воде при этом изменяется незначительно.

Теоретическая и практическая значимость. Апоптоз играет весьма важную роль в антиканцерогенезе. Нарушение нормального протекания апоптоза вследствие нарушения ионной регуляции клеточного объема может быть одной из причин развития опухолей. Изучение перестроек в этом аппарате при апоптозе имеет важное практическое значение. На это указывает большое количество работ, посвященных изучению ионных процессов при апоптозе.

Основные положения, выносимые на защиту:

Дегидратация клеток не является обязательным признаком апоптоза. При апоптозе с дегидратацией она обусловлена главным образом снижением внутриклеточного содержания K+ и Cl-. Концентрация K+ во внутриклеточной воде при этом изменяется незначительно. Апоптоз без дегидратации сопровождается изменением соотношения в клетке K+ и Na+ без изменения суммарного внутриклеточного содержания этих катионов. Изменения ионного и водного баланса при апоптозе в зависимости от глубины апоптоза и особенностей клеток обусловлены в одних случаях преимущественно изменением активности Na+/K+ насоса, а в других - изменением состояния K+ каналов либо комбинацией этих изменений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I и II Всероссийских съездах Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2006) и на научных семинарах Лаборатории физиологии клетки Института цитологии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 9 работ (6 статей).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 80 страницах и включает 14 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клеточные культуры. Исследование проводили на двух сублиниях культуры клеток гистиоцитарной лимфомы U937 (U937-160B2 и U937-9957), полученных из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Контрольные и опытные препараты инкубировали в атмосфере 5 % CO2 при 37 оС в течение 4-5 ч при концентрации клеток 0.7 - млн/мл в среде RPMI 1640 (Биолот, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки (FBS HyClone Standard).

Индукция апоптоза. При индукции апоптоза среда содержала 0.21 мкМ стауроспорин (Sigma) или 50 мкМ этопозид (Sigma). Концентрированные растворы стауроспорина (2мМ) и этопозида (34 мМ) готовили на DMSO. Конечная концентрация DMSO составляла 0.1-0.5 %.

Определение внутриклеточного содержания воды по плавучей плотности клеток.

Определение плавучей плотности клеток проводили в непрерывном градиенте Перколла (Pharmacia). Раствор Перколла готовили путем разбавления исходного препарата средой RPMI до концентрации 35-40 %. Для создания изоосмотичной среды к раcтвору Перколла добавляли 10-кратный концентрат среды Хенкса. Формирование градиента плотности проводили центрифугированием полученного раствора в пробирках 908 мм в течение 40 мин при 2000 g в угловом роторе центрифуги K-23 (Janetzki, ГДР). Плотность контролировали маркерами 1.033, 1.049, 1.062 г/мл (Sigma). Содержание в клетке воды на 1 г белка (v) находили по формуле: v.= (1-/dry)/[0.65(-1)], где - измеренная плавучая плотность клетки. В расчетах принимали, что плотность сухой массы dry = 1.35 г/мл и что белок составляет 79 % сухой массы. Сконцентрированную суспензию клеток объемом 100 мкл (3-5 млн. клеток) наслаивали на поверхность раствора Перколла и центрифугировали в течение 10 мин при g в бакет-роторе центрифуги MPW-340 (Польша). Фракции отбирали шприцем и после разбавления средой RPMI в 4-6 раз центрифугировали 5 мин при 300 g. Осадок ресуспендировали в среде RPMI и использовали для определения ионного состава, микроскопирования и проточной цитометрии.

Определение внутриклеточного содержания K+, Na+ и Rb+. Клетки после осаждения центрифугированием 5 раз промывали раствором MgCl2 (96 мМ) без ресуспендирования.

Отмытый осадок заливали 1 мл 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Концентрацию катионов в супернатанте определяли эмиссионным анализом в воздушно-пропановом пламени на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin-Elmer АА-306. В качестве калибровочных растворов использовали растворы KCl, NaCl (10100 мкМ) и RbCl (510 мкМ), приготовленные на 5 %-ной трихлоруксусной кислоте. Содержание ионов в клетке рассчитывали в миллимолях на 1 г белка. Количество белка в осадке определяли по Лоури с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

Измерение уабаин-чувствительного и уабаин–резистентного входного потока Rb+. Исходный 50 мM раствор RbCl добавляли к 1 мл клеточной суспензии (1106 клеток) до получения концентрации 2.5 мM. Инкубация клеток с Rb+ длилась 10 мин в среде без уабаина или с уабаином в концентрации 0.1 мM (Sigma). Ранее было показано, что Rb+ является аналогом K+ и что уабаин–чувствительный вход Rb+ должен измеряться в течение короткого временного интервала (510 мин), так как действие уабаина на более долгих сроках приводит к существенному увеличению внутриклеточного содержания Na+.

Определение внутриклеточного содержания хлора. Для определения внутриклеточного содержания хлора клетки помещали на 90 мин в среду, содержащую изотоп 36Сl (12 мкКюри мл-1, Изотоп, Россия). Радиоактивность 36Сl в экстракте, полученном добавлением к клеточному осадку 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, измерялась в сцинтилляционном счетчике (Beckman LS 6500).

Микроскопия и проточная цитометрия. Исследование флуоресценции нативных клеток, окрашенных акридиновым оранжевым (АО), измерение интенсивности малоуглового светорассеяния и определение содержания ДНК на фиксированных препаратах проводили на проточном цитофлуориметре (Розанов, 1988; Розанов и др., 1990). Для возбуждения флуоресценции использовали ртутную лампу ДРШ-250-2, а при измерении малоуглового светорассеяния – гелий-неоновый лазер (633 нм). Окрашивание клеток АО (5 мкг/мл) проводили в течение 1520 мин при комнатной температуре и концентрации клеток 1 млн/мл. Флуоресценцию возбуждали через интерференционный светофильтр с областью пропускания 450490 нм; регистрацию флуоресценции проводили в спектральных участках = 530 ± 5 нм и > 620 нм. Для определения содержания ДНК клетки переводили в раствор, содержащий: ЭДТА 0.02 %, MgCl2 15 мМ, Тритон Х-100 0.1 %, бромистый этидий (БЭ) 20 мкг/мл и оливомицин 40 мкг/мл, pH 7.4. Окрашивание проводили при температуре 46 оС в течение 2024 ч.

Флуоресценцию возбуждали через фильтр CC-15 (380-470 нм), регистрацию проводили при > 600 нм.

Для прижизненного микроскопирования клеток U937 использовали флуоресцентный микроскоп МИКМЕД-2 (LUMAM PRO-11, ЛОМО) или конфокальный сканирующий микроскоп Leica TCS SL. В первом случае клетки окрашивали в течение 5 мин смесью АО (мкг/мл) и БЭ (20 мкг/мл) или Hoechst 33342 (2 мкг/мл, 15 мин). Использовали блок фильтров «Зеленая», а в случае Hoechst 33342 – «Голубая». При работе с микроскопом Leica клетки окрашивали либо смесью АО и БЭ, либо сначала 10 мин мембранотропным зондом RH414, а затем 5 мин АО. Сканирование проводили в двух спектральных диапазонах: 500550 нм и 600700 нм, возбуждая флуоресценцию лазером 488 нм. На приведенных фотографиях оба изображения совмещены программой Zeiss LSM image browser 3.2.0.70. Диаметр клеток измеряли по фотографиям, полученным на микроскопе Leica TCS-SL, с помощью программы Image J 1.29.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t-теста Стьюдента. За порог достоверности различий принимали значение P = 0.05. Приводимое ниже число n соответствует, как правило, числу опытов, поставленных в разные дни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Апоптоз, вызванный стауроспорином, сопровождается дегидратацией.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»