WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Фенотипическая характеристика получаемых культур. Для доказательства эндотелиальной природы клеток, формирующих колонии, были использованы методы иммуногистохимии и проточной цитометрии. Несмотря на вариабельность по интенсивности окрашивания, преобладающее число клеток в колониях содержало фактора Виллебранда (ФВ), что подтверждает их эндотелиальную природу. Кроме этого, в некоторых крупных колониях на поверхности клеток, распластанных на пластике и составляющих монослой, наблюдались клеточные тяжи, напоминающие капилляроподобные структуры. Клетки, формирующие эти образования, также положительно окрашивались на ФВ.

При пассировании культур, содержащих несколько крупных эндотелиальных клонов, клетки сохраняли высокую пролиферативную активность и через 10-12 дней культивирования формировали конфлуэнтный монослой. Высокие темпы роста клеток сохранялась и при последующих пассажах. При иммунофенотипическом анализе клетки характеризовались наличием совокупности маркеров, подтверждающих их эндотелиальную природу (ICAM-1, PECAM-1, CD146, ФВ, VEGFR-2, CD34) (Рис. 10).

CD31 CDvWF CD62E Рисунок 10.

Фенотипическая характеристика эндотелиальных клеток (3 пассаж).

CD146 CD62P KDR CDПредставленные экспериментальные данные позволяют заключить, что через определенный период после проведения противоопухолевой терапии в крови появляются клетки, способные к инициации культуры эндотелия и к образованию капилляроподобных структур. По-видимому, появление в крови клеток с высоким уровнем пролиферации и способностью к колониеобразованию может быть обусловлено высокой потребностью к восстановлению целостности поврежденного сосудистого эндотелия. Несовпадение данных, полученных с помощью проточной цитометрии и культивирования, может быть объяснено тем, что лишь часть выявляемых по фенотипу циркулирующих клеток клоногенны в описанной системе культивирования. Отсутствие функциональных КОЕ-Энд в крови пациентов в период введения препаратов и в крови здоровых доноров может объясняться либо их нежизнеспособностью, либо слишком малым их количеством, выходящим за пределы чувствительности метода.

Вопрос о происхождении циркулирующих эндотелиальных клеток, составляющих "вторую волну", не имеет однозначного ответа. С одной стороны, возможным источником эндотелиальных клеток может быть сама сосудистая стенка. Об этом свидетельствуют данные, полученные Lin и соавт.: большинство клеток-предшественников эндотелия, циркулирующих в крови (более 95%), имеют не костномозговое происхождение [Lin, 2000].

Результаты работ нескольких других коллективов доказывают присутствие в сосудистой стенке резидентных клеток-предшественников, являющихся источником постнатального васкулоогенеза. Так называемые “васкулярные” зоны имеются в артериях большого и среднего калибра, а также в венах всех органов и систем [Zengin, 2006; Hu, 2004; Ingram, 2005]. Результаты наших собственных исследований и ранее полученные данные также показали присутствие в монослое сосудистого эндотелия популяции “камбиальных” эндотелиальных клеток с высоким пролиферативным потенциалом и обладающих клоногенными свойствами в культуре клеток [Романов, 1998, 1999]. С другой стороны, нельзя исключить, что клетки, выделенные из крови больных, имеют костномозговое происхождение и способны мигрировать в места повреждения эндотелия с восстановлением его целостности, что согласуется с данными, представленными другими авторами [Hur, 2004; Gulati, 2003; Shi, 1998]. В эту же пользу говорят и наблюдения, сделанные в ходе данного исследования: клетки «второй волны» негативны в отношении маркера дифференцированных эндотелиальных клеток – CD146.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе проведения экспериментов удалось установить, что и цитарабин, и даунорубицин способны оказывать повреждающее воздействие на культуру эндотелиальных клеток человека. Однако характер влияния этих двух препаратов на клетки оказался различен. Основной мишенью цитарабина являются пролиферирующие эндотелиальные клетки, и его цитостатическое действие можно охарактеризовать как фазовозависимое. При этом, несмотря на гибель значительной части клеток, целостность монослоя эндотелия не нарушается. Диаметрально противоположное действие на культуру эндотелиальных клеток продемонстрировал антрациклиновый антибиотик даунорубицин. В широком диапазоне концентраций препарат оказывал выраженный цитотоксический эффект вне зависимости от фазы клеточного цикла. Подобное повреждение эндотелиальных клеток приводило к нарушению целостности монослоя, т.е. деэндотелизации поверхности. При совместном применении цитарабина и даунорубицина выявлено, что эндотелиотоксичность смеси определяется, главным образом, антрациклиновым антибиотиком.

Моделирование цитостатического воздействия с использованием культур эндотелия позволило оценить функциональные изменения эндотелиальных клеток на фоне “терапии” цитарабином. Полученные данные доказывают, что в ответ на добавление препарата происходит активация эндотелиоцитов, которая проявляется, прежде всего, изменением экспрессии различных классов молекул клеточной адгезии и усилением взаимодействия с клетками периферической крови. Можно предположить, что аналогичные (генерализованные) провоспалительные изменения могут возникать и в сосудистой стенке в процессе лечения. Нельзя также исключить, что дисфункция эндотелия является ведущим патогенетическим фактором в развитии сосудистых осложнений у онкогематологических больных в ответ на цитостатическую терапию.

Исследования репаративной способности эндотелия in vitro показали, что восстановление эндотелиальной ткани может осуществляться несколькими путями. При незначительных повреждениях, вызванных кратковременным присутствием цитостатического препарата, целостность монослоя поддерживается за счет распластывания сохранившихся клеток. В последующие несколько дней количество эндотелиальных клеток и плотность культуры восстанавливаются в результате интенсивной клеточной пролиферации. При увеличении продолжительности цитостатического воздействия и истощении пула пролиферирующих клеток поддержание целостности монослоя осуществляется практически исключительно за счет распластывания клеток, оставшихся в культуре. Интересно, что даже после длительного присутствия в среде цитарабина и полной элиминации клеток, способных к делению, эндотелий все же сохраняет способность к регенерации. Это связано с сохранением в составе монослоя покоящихся клеток, не подверженных воздействию фазозависимого препарата. Данные клетки по праву можно назвать “тканевыми клетками-предшественниками эндотелия” или “колониеобразующими единицами эндотелия”. После окончания "курса" эти клетки способны активироваться и продуцировать клоны клеток, приводящих к восстановлению структуры эндотелия. Приведенные факты свидетельствуют о "физиологичности" процессов репарации эндотелия в описанной культуральной системе, чего нельзя сказать об изменениях эндотелиальных клеток в ответ на добавление даунорубицина. В результате проведенных экспериментов по выявлению КОЕ-Энд было установлено, что их реакции на этот препарат, по всей видимости, необратимы.

Доказательством правоты концепции повреждения эндотелия при цитостатической терапии пациентов с ОМЛ, а возможно, и с другими патологическими состояниями, является выявление циркулирующих эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке.

Исследование крови больных ОМЛ, которым проводилась цитостатическая терапия, полностью подтвердило высказанное предположение. Уже в первые дни лечения содержание циркулирующих эндотелиальных клеток возрастало (иногда, в десятки раз) по сравнению с исходным уровнем и снижалось после окончания курса. Результаты анализа фенотипа циркулирующих эндотелиальных клеток с использованием нескольких маркеров эндотелия (CD54, CD34, CD146) свидетельствуют, что в процесс повреждения вовлечены клетки, выстилающие как магистральные сосуды, так и капиллярное русло.

Одним из возможных механизмов регенерации эндотелия связан с участием недифференцированных эндотелиальных клеток. Если данный механизм задействован и в случае регенерации эндотелия после проведенной химиотерапии, то жизнеспособные эндотелиальные клетки-предшественники, способные к клональному росту, должны присутствовать в крови пациентов в период восстановления. Действительно, проведенный анализ показал, что через 7-9 суток после окончания курса в крови пациентов определяется популяция CD45-негативных клеток, экспрессирующих эндотелиальные маркеры – CD54 и CD34 (но не CD146). Высокий уровень таких клеток сохраняется на протяжении 1-2 недель и затем снижается. При посадке суммарной фракции лейкоцитов периферической крови, выделенной в период выброса предполагаемых предшественников, и последующем культивировании вначале выявлялись единичные клетки, в дальнейшем – колонии клеток с морфологическими и фенотипическими признаками эндотелия.

Таким образом, проведенное исследование доказывает высокий уровень повреждения сосудистого эндотелия у пациентов, получающих цитостатическую терапию, и расширяет сложившиеся представления о механизмах регенерации эндотелия и развития сосудистой патологии у больных гемобластозами.

ВЫВОДЫ 1. Разработана экспериментальная модель, позволяющая оценить повреждающее действие цитостатических препаратов (цитозин-арабинозада, даунорубицина) на эндотелиальные клетки человека.

2. Повреждающее действие цитозин-арабинозида проявляется в широком диапазоне концентраций (0,1 мкг/мл – 1 мг/мл) и связано с элиминацией из состава монослоя пролиферирующих клеток, не приводящей к нарушению целостности клеточного пласта.

Действие даунорубицина в концентрациях от 0,1 мкг/мл до 0,1 мг/мл сопровождается нарушением целостности монослоя вследствие необратимых токсических повреждений эндотелиальных клеток.

3. При короткой экспозиции цитозин-арабинозида (1-3 суток), целостность монослоя эндотелиальных клеток сохраняется за счет распластывания сохранившихся клеток и последующего восстановления плотности культур в результате их пролиферации. При продолжительной (7-9 суток) инкубации культур с препаратом поддержание целостности монослоя происходит исключительно за счет распластывания эндотелиальных клеток.

4. После продолжительной инкубации с цитозин-арабинозидом, в культуре сохраняется популяция колониеобразующих клеток (КОЕ-Энд), способных к пролиферации с последующей регенерацией монослоя. В культурах эндотелиальных клеток, инкубированных с даунорубицином, КОЕ-Энд не выявлены и восстановления целостности монослоя не происходит.

5. Функциональные изменения эндотелиальных клеток при культивировании в присутствии цитозин-арабинозида аналогичны провоспалительным: возрастает экспрессия различных классов молекул клеточной адгезии (P- и Е-селектинов, ICAM-1, VCAM-1 и PECAM-1) и увеличивается адгезия клеток крови на эндотелий.

6. В крови здоровых доноров и больных ОМЛ выявлены популяции клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45-, соответствующим циркулирующим эндотелиальным клеткам. На фоне введения цитостатических препаратов содержание циркулирующих клеток эндотелия увеличивается в среднем в 10 раз и снижается после окончания курса цитостатической терапии.

7. Через 1-2 недели после окончания курса химиотерапии в крови пациентов наблюдается "вторая волна" увеличения количества циркулирующих эндотелиальных клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45-, но не CD146+/CD45-, среди которых присутствуют клетки-предшественники эндотелия (КОЕ-Энд).

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Романов Ю.А., Червонцева А.М., Савченко В.Г. Повреждение сосудистого эндотелия в процессе лечения острых лейкозов: исследование in vitro. Терапевтический архив. 2004;

№ 7, стр. 34-40.

2. Романов Ю.А., Червонцева А.М., Савченко В.Г. Влияние цитарабина на экспрессию молекул клеточной адгезии и взаимодействие эндотелий-лейкоцит in vitro.

Терапевтический архив, 2006, № 7, стр. 67-72.

3. Chervontseva A.M., Savchenko V.G., Romanov Y.A. Injury of endothelium during the cytostasic therapy of AML patients. The American Society of Hematology 46th Annual Meeting and Exposition.

Abstract

3907. 2004.

4. Romanov Y.A., Chervontseva A.M., Savchenko V.G. Vascular endothelium: target or victim of cytostatic therapy ISCT Annual Meeting, May 2-5 2006, Berlin, Germany, abstr/poster.

5. Romanov Y.A., Chervontseva A.M., Savchenko V.G. Vascular endothelium: target or victim of cytostatic therapy Can. J. Physiol. Parmacol. 2007; 85: 396-403.

6. Savchenko V.G., Chervontseva A.M., Romanov Y.A. Vascular damage by cytostatic drugs in acute leukemia patients. Workshop “Modelling of blood diseases”, November 5-8 2007, Lion, France, abstract p. 9.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»