WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Рисунок 3. Влияние цитозин-арабинозида на включение БДУ в культуре эндотелиальных клеток человека. А – контрольные клетки; Б и В – то же, в присутствии цитозин-арабинозида, 100 мкг/мл и 200нг/мл, соответственно. Иммунопероксидазная техника, Х200.

Морфологические изменения эндотелиальных клеток под действием даунорубицина. В широком диапазоне концентраций (от 1,5 мкг/мл до 0.1 мг/мл) даунорубицин оказывал выраженное цитотоксическое действие, приводящее в течение 24 часов к повреждению значительной части эндотелиальных клеток (Рис. 2Б) и нарушению целостности монослоя (Рис. 4Б). При уменьшении концентрации препарата до 0,4-0,75 мкг/мл число прикрепленных к пластику клеток возрастало, но монослой по-прежнему был нарушен. Лишь при концентрации даунорубицина в среде, равной или менее 200 нг/мл жизнеспособные эндотелиальные клетки были способны оставаться в состоянии монослойной культуры, несмотря на гибель части из них (Рис. 4В). Увеличение времени инкубации с препаратом до 48 часов приводило к возрастанию его эффекта примерно вдвое.

Рисунок 4. Морфологические изменения в культуре эндотелиальных человека при инкубации с даунорубицином (Б-В) и цитозин-арабинозидом (Г-Е).

А – контрольные клетки; Б и В – клетки после 48 часов инкубации с ДНР, 5 мкг/мл и нг/мл, соответственно; Г и Д – вид культур через 48 часов и 7 суток инкубации с цитозинарабинозидом, 10 мкг/мл; Е – культура Д: появление колоний ЭК через 10 суток после удаления цитозин-арабинозида из среды культивирования. Фазовый контраст, Х100.

Изменения эндотелиальных клеток при совместном применении цитозин-арабинозида и даунорубицина. С целью выявления возможного потенциирования действия двух препаратов, было проведено исследование по их одновременному добавлению в культуральные среды. Как видно из рисунка 2 В и Г, разница между количеством эндотелиальных клеток, инкубированных с цитозин-арабинозидом в широком диапазоне концентраций и даунорубицином в дозе 0,75 мкг/мл и “монотерапией” цитозин-арабинозидом составила 25%. В тоже время кривые, соответствующие содержанию клеток после воздействия разных доз даунорубицина в присутствии или отсутствии цитарабина (мкг/мл), практически идентичны.

Таким образом, при совместном использовании препаратов было установлено, что цитозин-арабинозид практически не оказывает влияния на эффекты даунорубицина, а цитотоксичность смеси определяется в основном антрациклиновым антибиотиком.

Репарация культуры эндотелия. Колониеобразующие единицы эндотелия. На основании ранее полученных данных о схожести воздействия доз цитозин-арабинозида на эндотелиальные клетки в широком диапазоне концентраций для последующих экспериментов был выбран препарат цитарабин в условной "терапевтической" дозе, равной 10 мкг/мл среды.

При увеличении времени инкубации эндотелиальных клеток с цитарабином до 6-суток в культуре наблюдалось прогрессивное снижение их плотности, вплоть до 15-20% от исходной. При этом целостность монослоя сохранялась за счет сильно распластанных клеток, оставшихся на пластике (Рис. 4Д). После "отмены" препарата, т.е. отмывки и последующего культивирования клеток эндотелия в стандартной среде, морфология культур оставалась практически неизменной на протяжении последующих 7-9 суток. Однако при дальнейшем культивировании на фоне разреженного монослоя было отмечено возникновение отдельно расположенных островков, состоящих из мелких активно пролиферирующих клеток (Рис. 4Е). В последующие несколько суток размеры возникших клеточных колоний продолжали возрастать, в результате чего культуры практически полностью восстанавливались.

Для подтверждения присутствия в составе культур колониеобразующих клеток была предпринята попытка их выявления с помощью метода клонирования. В результате проведенных экспериментов было установлено, что при плотности посадки порядка 10-эндотелиальных клеток/см2 отдельные клетки способны пролиферировать и в течение 2-недель формировать колонии, содержащие от нескольких десятков до нескольких сотен клеток. Способность культур к клонированию сохранялась после инкубации клеток с цитарабином. Однако число колониеобразующих единиц после длительной инкубации с цитарабином было ниже, чем в контрольных культурах (в среднем 1 на 1000 посаженных клеток) и к 14-15 суткам составляло около 1 на 2-3 тысячи.

Ни появления отдельных колоний эндотелиальных клеток, ни восстановления целостности монослоя, ни присутствия колониеобразующих клеток в культурах, подвергнутых клонированию после инкубации с даунорубицином, в аналогичных условиях культивирования выявлено не было.

Влияние цитарабина на адгезивные параметры эндотелия. При изучении экспрессии молекул клеточной адгезии было установлено, что контрольные культуры практически не содержали клеток, экспрессирующих на своей поверхности Р- и Е-селектины и VCAM-1 (Рис.

5А). В то же время почти все клетки содержали умеренное количество ICAM-1 и положительно окрашивались на PECAM-1 (Рис. 5Д и Ж). В результате 48-72-часовой инкубации с цитарабином эндотелиальные клетки претерпевали ряд структурнофункциональных изменений, описанных выше. Одновременно, при иммуногистохимическом анализе в культурах было отмечено появление клеток, экспрессирующих на поверхности Рселектин, Е- селектин, а также молекулу клеточной адгезии семейств иммуноглобулинов VCAM-1 (Рис. 5, Б-Г, соответственно). Окрашивание на PECAM-1 становилось более интенсивным по сравнению с контролем (Рис. 5, З). Наиболее выраженные изменения (значительное увеличение экспрессии) были выявлены в отношении ICAM-1 (Рис. 5, Е).

А Б Рисунок 5.

Экспрессия молекул клеточной адгезии в культуре эндотелиальных клеток после часов инкубации с цитозин-арабинозидом.

В Г А – контрольные клетки (рисунок соответствует негативному окрашиванию на Р-селектин, Е-селектин и VCAM-1); Б-Г – экспрессия Р-селектина, Е-селектина и VCAM-1 в культуре после инкубации с препаратом, соответственно; Д-Е и Ж-З – экспрессия ICAM-1 и PECAM-1 до и после Д Е добавления цитозин-арабинозида в культуральную среду, соответственно.

Иммунопероксидазное окрашивание, Х200.

Ж З Рисунок 6.

Адгезия мононуклеарных клеток здорового донора к контрольным эндотелиальным клеткам (А) и культурам после инкубации с цитарабином (Б).

Окрашивание по методу Гимза.

Увеличение, Х 250.

Результаты гистохимического окрашивания были подтверждены методом проточной цитометрии. Число клеток, экспрессирующих Р-селектин, Е-селектин и VCAM-увеличивалось и в ряде случаев достигало 2-3%. Доля ICAM-1-положительных клеток и интенсивность окрашивания также возрастали после инкубации эндотелиальных клеток с цитарабином. Некоторое усиление окрашивания клеток по сравнению с контрольными культурами отмечалось и в случае PECAM-1.

При исследовании адгезивных свойств клеток в контрольных культурах наблюдалась лишь незначительная адгезия мононуклеаров периферической крови – 1,1±0,3 лейкоцита на 10 эндотелиоцитов (Рис. 6 А). После 48-72-часовой инкубации с цитарабином, несмотря на объективное снижение плотности монослоя эндотелиальных клеток, количество адгезировавших лейкоцитов значительно возрастало по сравнению с контрольными культурамии составляло 24,3±5,7 лейкоцитов на 10 эндотелиоцитов (Рис. 6 Б). При этом значительная часть мононуклеаров за 30 минут эксперимента успевала мигрировать в субэндотелиальное пространство. Сходные результаты были получены при анализе адгезии мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациентов, проходящих курс химиотерапии по поводу острого лейкоза.

2. Циркулирующие эндотелиальные клетки. Колониеобразующие единицы эндотелия.

Динамика изменения содержания эндотелиальных клеток в крови больных в процессе лечения. Результаты экспериментов, описанные в предыдущих разделах, показали, что цитарабин и даунорубицин обладают способностью приводить к гибели и появлению в культуральной среде значительного количества свободно плавающих эндотелиальных клеток. По аналогии с исследованиями in vitro, можно предположить, что клетки, подвергшиеся воздействию цитостатических препаратов, также слущиваются с поверхности сосудистой стенки и оказываются в периферическом кровотоке.

Поскольку экспрессия исследуемых маркеров (CD54, CD34, CD146) описана и на активированных лимфоцитах, для исключения ложноположительных результатов проводили двойное окрашивание с использованием антител к общелейкоцитарному антигену CD45. За циркулирующие эндотелиальные клетки принимали события с фенотипом CD54+/СD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45- (Рис. 7). Динамика изменений количества клеток с характерным антигенным профилем (молекула клеточной адгезии эндотелия+/CD45-) суммирована на рисунке 8.

Перед началом введения цитостатических препаратов уровень эндотелиальных клеток в крови больных ОМЛ варьировал в широких пределах (CD54+/CD45- от 10 до 466;

CD34+/CD45- от 32 до 453; CD146+/CD45- от 53 до 104 клеток/мл). Наименьшее их количество выявлялось у больных после предшествующего лечения стандартными дозами цитарабина с даунорубицином. В контрольной группе здоровых доноров среднее число клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146+/CD45- составило 44, 22,5 и клеток/мл, соответственно, что согласуется с результатами большинства исследователей [Del Papa, 2004; Khan, 2005].

CD 34 CD 146 CD 34 CD CD 54 CD 34 CD 146 CD 54 CD 34 CD CD 54 CD ДО ЛЕЧЕНИЯ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ Рисунок 7. Результаты выявления циркулирующих клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146/CD45- в крови больного Т.В.О. до лечения и на 5 сутки терапии.

Рисунок 8. Динамика изменения содержания циркулирующих клеток с фенотипом CD54+/CD45-, CD34+/CD45- и CD146/CD45- в крови больного З.Т.Ф. в процессе лечения и в послекурсовом периоде.

Как следует из рисунка 8, динамика выброса CD34+/45- клеток в кровоток практически совпадала с данными, полученными при анализе клеток с фенотипом CD54+/CD45-.

Количество циркулирующих эндотелиальных клеток, экспрессирующих CD146, также повышалось в процессе химиотерапии, но в отличие от предыдущих популяций, изменения наблюдались в более ранние сроки и были менее выражены.

Сравнительный анализ количественных изменений эндотелиальных клеток в крови больных показал различную степень повреждения сосудистого эндотелия в зависимости от используемых схем цитостатической терапии. При проведении курсов высоких доз цитарабина в сочетании с митоксантроном в первые три дня лечения наблюдалось повышение CD54+/CD45- клеток в 3,6-5,3 раз по сравнению с исходным уровнем, что совпадало с введением цитозин-арабинозида. Последующее применение митоксантрона поддерживало достаточно высокие значения эндотелиальных клеток, превышающие, в одном случае, число клеток, определяемых в первые дни курса. В случае использования высокодозной монотерапии цитарабином кратность увеличения уровня CD54+/CD45клеточной популяции составила 5,6 раз. Использование в терапии антрациклинового антибиотика даунорубицина приводило к нарастанию числа эндотелиальных клеток в периферическом кровотоке в 9-24 раза. Существенный подъем CD34+/45-клеток наблюдался у двоих больных на программах “7+3” и “HDAra-C” (в 25 и 44 раза, соответственно). При анализе клеток крови с фенотипом CD146+/CD45- их количественное содержание увеличивалось в 3-8 раз по сравнению с исходными значениями.

В послекурсовом периоде заметное повторное увеличение клеточных популяций CD54+/CD45- и CD34+/CD45- отмечалось на 7-9 сутки после окончания курса химиотерапии.

У большинства больных количество циркулирующих CD54+/CD45- клеток возрастало по сравнению с исходными данными в 6-25 раз, а CD34+/CD45- в 4-22 раза, что превышало значения, полученные на фоне проведения цитостатической терапии. При этом уровень лейкоцитов крови у шести больных находился в пределах от 0,2 до 0,9х109/л, лишь у одной пациентки он составлял 2х109/л. Таким образом, наблюдаемое увеличение содержания циркулирующих эндотелиальных клеток приходилось на период агранулоцитоза или выраженной цитопении. В течение дальнейшего наблюдения количество клеток (CD54+/CD45-, CD34+/CD45-) у всех пациентов в крови снижалось, но сохранялось выше значений, которые имелись в начале исследования. Число клеток, экспрессирующих CD146, напротив, оставалось повышенным или несколько увеличивалось на вторые сутки после лечения с последующим плавным снижением их количества в крови практически до исходного уровня.

В целом полученные результаты подтверждают предположение о массивной деэндотелизации сосудистой поверхности в ходе цитостатической терапии. Включение в программу лечения даунорубицина значительно повышает риск нарушения целостности эндотелиального слоя, что согласуется с приведенными выше результатами исследований in vitro. Последующий подъем («вторая волна») числа циркулирующих эндотелиальных клеток, предшествующий по времени началу выхода пациентов из агранулоцитоза дает основание предположить, что эти клетки жизнеспособны и, возможно, являются клеткамипредшественниками, способными участвовать в регенерации эндотелия. Доказательством этому могло бы стать выявление функциональных КОЕ-Энд в крови.

Формирование колоний эндотелиальных клеток в культуре лейкоцитов крови. Через 4-6 дней от момента посадки мононуклеаров крови, забранной на пике «второй волны», в культуре отмечалось появление единичных распластанных клеток, морфологически сходных с эндотелиальными. В дальнейшем эти клетки формировали очаги роста, которые со временем увеличивались в размерах. К 9-15 суткам культивирования некоторые колонии достигали диаметра 3-5 мм и насчитывали до нескольких тысяч клеток (Рис. 9).

Рисунок 9.

Вид колоний эндотелиальных клеток после 3-4 недель культивирования лейкоцитов крови больных ОМЛ. (Нижнее фото соответствует 4 полям зрения микроскопа).

Фазово-контрастная микроскопия, х100.

Число клеточных колоний, возникающих на 10-15 сутки культивирования, варьировало у изолятов, полученных из крови пациентов после проведения комбинированной терапии, и составляло от 9 до 25 при посадке лейкоцитов в количестве от 9 до 28х106 (cреднее 14,5±7,8х106), выделенных из 20 мл крови. При посадке лейкоцитов крови пациента после проведенной монотерапии высокими дозами цитозин-арабинозида роста клеточных колоний отмечено не было. Аналогичные негативные результаты были получены при исследовании крови здоровых доноров и пациентов на момент введения цитостатических препаратов.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»