WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

даунорубицина - 0,1 мкг/мл - 0,1 мг/мл. В ряде экспериментов использовали сочетание различных концентраций обоих препаратов. После добавления препаратов среды тщательно перемешивали, и культуры возвращали в СО2-инкубатор. Оценку морфологических и количественных изменений проводили ежедневно с помощью фазовоконтрастной микроскопии.

Оценка цитостатического и цитотоксического эффекта.

По числу прикрепленных клеток. Клетки высаживали в 24- или 48-камерные культуральные планшеты с плотностью порядка 103 клеток/см2 и культивировали до формирования монослоя. После 24-часовой инкубации с препаратами в исследуемом диапазоне концентраций эндотелиальные клетки отмывали раствором Эрла, фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида на ФБД рН=7.2-7.4, окрашивали 0,1% водным раствором толуидинового синего, отмывали дистиллированной водой и высушивали. Для подсчета числа клеток применяли метод компьютеризированной видеомикроскопии [Романов, 2003;

Мерзликина, 2005; Romanov, 2007]. На распечатках нескольких случайно выбранных полей зрения микроскопа производили подсчет количества прикрепленных к пластику эндотелиальных клеток для каждой концентрации препаратов. За 100% принималось число клеток в контрольных культурах.

По включению меченого предшественника синтеза ДНК. Перед проведением эксперимента исходный концентрат бромодеоксиуридина (БДУ, Cell Labeling Kit, BRDU, Amersham, США) разводили в стерильной культуральной среде в соответствии с рекомендациями фирмыпроизводителя. Через 24 часа после добавления исследуемых препаратов в контрольные и опытные культуры эндотелиальных клеток добавляли БДУ и инкубировали на протяжении последующих 18 часов. Пролиферирующие клетки выявляли с помощью иммуногистохимии:

культуры отмывали раствором Эрла, фиксировали 15 мин охлажденным до -18С метанолом и высушивали. После регидратации культуры обрабатывали смесью нуклеазы и моноклональных антител к БДУ в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Дальнейшие этапы окрашивания проводили с использованием биотин-стрептавидинпероксидазной техники с применением набора реактивов Histoscan в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Monoclonal Detector Kit, Biomeda, США).

Результаты оценивали с помощью световой микроскопии.

Выявление колониеобразующих единиц эндотелия (КОЕ-Энд). Эксперименты выполняли в двух модификациях. В первом случае культуры эндотелия инкубировали по отдельности с цитарабином и даунорубицином в течение 7 суток. Смена культуральных сред на свежие и новые добавления препаратов проводились ежедневно. Затем культуры отмывали и заменяли среду культивирования на стандартную. Последующие смены сред производили через 48 часов. Динамическое наблюдение за морфологическими и количественными изменениями культур, а также выявление очагов клонального роста проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии на протяжении 4-х последующих недель.

Во втором случае для подтверждения наличия КОЕ-Энд контрольные и прединкубированные с цитостатическими препаратами в течение 24-48 часов и 5-7 суток культуры эндотелиальных клеток снимали трипсином-ЭДТА и пересаживали на чашки Петри диаметром 60 мм в разведении 1:200 от исходной плотности монослоя. Через 3 недели культуры фиксировали и окрашивали толуидиновым синим, после чего подсчитывали число колоний, видимых невооруженным глазом.

Оценка адгезивных параметров эндотелиальных клеток и моделирование межклеточных взаимодействий. Для оценки изменения экспрессии клетками различных классов молекул клеточной адгезии культуры инкубировали в течение 48-72 часов с цитарабином в концентрации 10-20 мкг/мл. Контролем служили культуры, выращенные без добавления препарата. Клетки отмывали раствором Эрла и снимали раствором трипсинаЭДТА, затем осаждали центрифугированием и инкубировали в течение 45 минут с ФИТЦ- или ФЭ-мечеными мышиными моноклональными антителами к CD54 (ICAM-1), CD(VCAM-1), CD62-E (E-селектин), CD31 (PECAM-1) и CD62-P (Р-селектин) (Becton Dickinson).

В качестве негативного контроля использовали неиммунные IgG соответствующего класса (Becton Dickinson). После отмывки ФБД-БСА клетки ресуспендировали в растворе FaxFlow и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с использованием программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson).

Для подтверждения результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали иммуногистохимический анализ. Контрольные и инкубированные с цитарабином 10-20 мкг/мл в течение 48-72 часов культуры фиксировали на пластике в течение 15 мин раствором CellFix (Becton Dickinson), отмывали ФБД и ФБД с добавлением БСА (ФБД-БСА). Следующий этап включал в себя применение того же спектра нативных мышиных моноклональных антител, которые использовались при выявлении молекул клеточной адгезии методом проточной цитометрии. Дальнейшее окрашивание проводили с помощью набора реагентов, входящих в Monoclonal Detector Kit (Biomeda) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Результаты оценивались с помощью световой микроскопии.

Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров и больных методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла (1.077 г/л) с использованием готовой коммерческой среды LymphoSep (ICN) или Histopaque (SigmaAldrich). Полученные лейкоциты отмывали центрифугированием в избытке раствора Эрла и ресуспендировали в среде культивирования в концентрации 2х106 клеток/мл. Затем клеточную суспензию в равных объемах добавляли в культуральные среды контрольных и подвергшихся воздействию цитарабина эндотелиальных клеток. Через 30 минут инкубации неадгезировавшие клетки бережно отмывали раствором Эрла; культуры фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом на ФБД и окрашивали по методу Гимза. Количество адгезированных лейкоцитов оценивали с помощью метода компьютеризированной видеомикроскопии, описанного в предыдущих разделах.

Выявление циркулирующих эндотелиальных клеток.

Характеристика больных. В работе использовали образцы венозной крови здоровых доноров и больных ОМЛ, находящихся на лечении в клинике химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН (руководитель отделения член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор В.Г.Савченко). В исследование были включены 7 больных (женщин и 2 мужчин) в возрасте от 21 до 51 года (среднее 40±11). Основные характеристики пациентов приведены в Таблице 1. В контрольную группу было включено 3 здоровых донора: 2 женщины и 1 мужчина в возрасте 24, 31 и 34 лет.

Таблица 1. Характеристика пациентов.

Терапия на момент № Пациент Возраст Диагноз Предшествующее исследования пол лечение 1. С.А.А. 32 / М ОМЛ (М2) 1 курс “7+3 с “HAM” вепезидом -16”, “НАМ” 2. Т.А.Ж. 44 / Ж ОПЛ (М3) 1 курс “7+3” с “7+3” весаноидом 3. З.Т.Ф. 50 / Ж ОМонЛ 2 курса “7+3 с “HAM” (М5) вепезидом-16”, “НАМ” 4. Т.В.О. 21 / М ОММЛ 1 курс “7+3 с “HD-Ara-C” (М4) вепезидом -16”, 2 курса “НАМ” 5. Ш.О.М. 36 / Ж ОМЛ (М2) 2 курса “7+3 с “HAD” вепезидом -16”, “HAD” 6. К.И.А. 51 / Ж ОМЛ (М1- 1 курс “7+3 с “HAM” 2) вепезидом -16” 7. А.О.С. 45 / Ж ОМЛ (М1- 2 курса “7+3 с “7+3” 2) вепезидом -16” Варианты химиотерапии, проводимой больным на момент исследования:

• курс “7+3”: цитарабин 100 мг/м2 2 раза в сутки 1-7-й день; даунорубицин 45 мг/м2 или 60 мг/м2 1 раз в сутки 1-3-й день.

• курс ”НАМ”: цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 1-3-й день; митоксантрон 10 мг/м2 1 раз в сутки 3-5-й день.

• курс “HD-Ara-C”: цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 1-й, 3-й, 5-й день.

• курс “HAD”: цитарабин 3 г/м2 2 раза в сутки 3-5-й день; даунорубицин 45 мг/м2 1 раз в сутки 1-3-й день.

Интервал между предшествующим курсом химиотерапии и моментом начала обследования составлял от 33 до 63 дней (в среднем 44 дня). Определение и анализ количества эндотелиальных клеток в периферической крови проводились всем больным перед началом лечения, в процессе введения цитостатических препаратов и в течение длительного периода после химиотерапии. Каждому больному было выполнено от 5 до повторных исследований. В день взятия образцов параллельно выполняли исследование уровня лейкоцитов крови.

Подготовка и исследование образцов крови. Для определения циркулирующих эндотелиальных клеток у больных с ОМЛ применяли метод мультипараметрической проточной цитометрии. Из цельной гепаринизированной (50 Ед/мл) крови отбирали аликвоты в объеме от 100 мкл до 1000 мкл (в зависимости от содержания лейкоцитов).

Образцы объемом более 100 мкл предварительно центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин для осаждения всех клеточных элементов. После удаления избытка плазмы до получения конечного объема 100-150 мкл клетки инкубировали в течение минут при температуре +2-8С с антителами к CD45-ФИТЦ и одному из исследуемых маркеров: CD54-ФЭ, CD34-ФЭ, СD146-ФЭ (Вecton Dickinson). После лизиса эритроцитов (BD FACS Lysing Solution) клеточные суспензии анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson). Накопление данных прекращали после получения от 100000 до 250000 CD45-положительных событий (лейкоцитов) в каждом образце. За основу анализа был взят стандартный протокол выявления гемопоэтических стволовых клеток ISHAGE [Barnett,1999]. Циркулирующими эндотелиальными клетками считали события, определяемые как клетки с фенотипом CD45/CD34+ или CD45-/CD54+, или CD45-/CD146+, располагающиеся в левом верхнем углу графика FL1/FL-2. События с размерами меньше, чем у лимфоцитов, из анализа исключались. В дальнейшем проводился пересчет относительного содержания эндотелиальных клеток в соответствии с уровнем лейкоцитов крови на момент исследования.

Культивирование эндотелиальных клеток крови. Гепаринизированную кровь (20 мл) переносили в стерильную пробирку и оставляли на 30-60 минут для седиментации эритроцитов. Обогащенную лейкоцитами плазму переносили в отдельную пробирку и центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл среды для культивирования эндотелиальных клеток и помещали в культуральные флаконы с площадью поверхности 75 см2, заранее покрытые желатином. Через 5-7 дней среду с неприкрепившимися клетками удаляли и заменяли на свежую. Динамическое наблюдение за прикрепившимися клетками производили с помощью фазово-контрастной микроскопии на протяжении 4-6 недель.

При достижении колониями размеров около 1 - 4 мм культуры отмывали раствором Эрла и пассировали на желатинизированные флаконы площадью 25 см2 и продолжали культивирование до формирования монослоя. При необходимости клетки вновь пересевали с разведением 1:3.

Для подтверждения эндотелиальной природы полученных клеточных колоний и культур, полученных в результате пассирования, клетки анализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания и проточной цитометрии. В данной части исследования использовали мышиные моноклональные антитела к CD54 (ICAM-1), CD(VCAM-1), CD31 (PECAM-1), CD62P (P-селектину), CD62E (Е-селектину), CD34, CD146, VEGFR-2/KDR (R&D Systems, США) и кроличьи поликлональные антитела к фактору фон Виллебранда (Sigma, США).

С целью выявления в составе сформированного монослоя сохранных функциональных колониеобразующих единиц эндотелия культуры 2-3 пассажа пересевали на покрытые желатином культуральные флаконы 75 см2 в разведении 1:100 от исходной плотности монослоя (5-6х104 кл/см2). Динамическое наблюдение за формированием очагов клонального роста проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии в течение недель. В дальнейшем полученные колонии окрашивали толуидиновым синим либо фенотипировали с помощью ранее применявшихся антител к P-селектину и фактору фон Виллебранда.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Повреждение и репарация эндотелия in vitro.

Культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека 1-го и 2-го пассажей, использованные в работе, были представлены гомогенной популяцией одноядерных клеток веретеновидной или полигональной формы. При культивировании в среде, содержащей дополнительный фактор роста (ECGS) клетки активно пролиферировали, и при использовании БДУ индекс мечения культур в стадии активного роста достигал 40-60%. По мере достижения конфлюэнтного состояния (состояния монослоя) скорость роста клеток замедлялась вследствие контактного торможения, а культуры приобретали характерный вид "булыжной мостовой".

Влияние цитозин-арабинозида на морфологию и пролиферацию эндотелиальных клеток. В процессе отработки экспериментальной модели был исследован широкий диапазон концентраций препарата в среде культивирования, с запасом перекрывающий его содержание в крови больных при использовании средних (100 мг/м2) и высоких (3 гр/м2) доз.

При исследовании различных препаратов группы цитозин–арабинозида, полученных от различных фирм-производителей (цитозар, цитарабин, алексан), существенных различий в их активности выявлено не было (Рис. 1). Для оценки эффективности препаратов был проведен анализ их активности в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1 мг/мл. При фазово-контрастной микроскопии культур уже через 3-4 часа наблюдалось появление открепившихся свободно плавающих клеток, число которых визуально возрастало пропорционально времени инкубации и концентрации препарата в среде культивирования.

Рисунок 1.

Сравнительный анализ цитостатического действия различных препаратов на основе цитозин-арабинозида.

При 24-часовой инкубации действие цитозин-арабинозида сохранялось практически неизменным в широком диапазоне концентраций от 0,5 мкг/мл до 1 мг/мл и прекращалось (число клеток достигало контрольного уровня), при концентрации менее 100 нг/мл (Рис. 2А).

В серии экспериментов с применением БДУ было установлено, что мишенью цитозинарабинозида являются клетки, вступающие в митотический цикл. Добавление препарата приводило в течение 18-24 часов к полному исчезновению из культуры БДУ-меченых клеток.

Жизнеспособность пролиферирующих клеток сохранялась (меченые БДУ клетки выявлялись в составе монослоя) лишь при концентрациях препарата, не превышающих нг/мл (Рис. 3), что соответствовало данным, приведенным на рисунке 2А.

Параллельно с откреплением части клеток в культурах эндотелия, инкубируемых в присутствии цитарабина, наблюдалось снижение плотности монослоя по сравнению с контрольными (Рис. 4 А, Г). При времени инкубации, не превышающем 24-48 часов, действие препарата было обратимым: уже через 18-24 часа после отмывки и замены среды на свежую в культуре появлялось значительное количество БДУ-меченных, а в последующие сутки делящихся клеток.

Рисунок 2.

Изменение числа жизнеспособных ЭК при инкубации с различными концентрациями цитозинарабинозида (А), даунорубицина (Б) и их комбинаций (В и Г).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»