WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Восстановленные фолаты как объекты деградирующего воздействия ультрафиолета. Роль кислорода.

Для характеристики фолатов как участников фотобиологических процессов, а также в связи с перспективой применения фотохимических стадий в синтезе лекарственных форм фолатов, важно знать, в какой мере свет повреждает структуру молекул этих соединений. В работе исследована устойчивость к УФоблучению ДГФК, ТГФК и некоторых ее одноуглеродных производных.

5,10-Метенил-ТГФК функционирует в качестве фотоантенны в составе фоторецепторов в ДНК-фотолиазах и криптохромах. Для молекулы, выполняющей антенную функцию, важным свойством является фотоустойчивость, т.е. сохранность молекулы под воздействием облучения. В водных растворах молекула 5,10-метенил-ТГФК стабильна при рН 3,0. В работе исследована фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК в растворах с рН 3,0. При этих условиях фотохимические свойства 5,10-метенил-ТГФК (max 360 нм) наиболее близко соответствуют свойствам этой молекулы в составе белков (max 370 - нм). Проведено сравнение фотоустойчивости 5,10-метенил-ТГФК и ТГФК при рН 2,7. Параллельно сравнивали между собой фотоустойчивость восстановленных форм фолатов (7,8-ДГФК, ТГФК и 5-формил-ТГФК), не участвующих в физиологической рецепции света. Исследование проводили в растворах при рН 7,0, что соответствует условиям существования вышеперечисленных фолатов в организме.

Фотодеградация дигидрофолиевой, тетрагидрофолиевой и 5-формилтетрагидрофолиевой кислот.

В отсутствие облучения в деаэрированных (вакуумированных) растворах ДГФК, ТГФК и 5-формил-ТГФК (5х10-5 М) в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0) деградация вещества после 10 мин инкубации не превышала 4 %. Под воздействием ультрафиолета ( 290 ± 20 нм) она дополнительно увеличивалась только на 1-2 %. Квантовый выход продуктов фотодеградации (Ф) не превышал 0,01 (рис. 9). В аэрированных растворах этих соединений УФ-облучение (мин, 290 ± 20 нм) ускоряло процессы окисления и разложения ТГФК и 5формил-ТГФК (рис. 9). Квантовый выход продуктов фотодеструкции ТГФК составлял 0,075 ± 0,005, а в случае 5-формил-ТГФК - 0,027 ± 0,005. Следовательно, наличие формильного заместителя в положении N5 в молекуле 5-формилТГФК препятствует темновому окислению и способствует устойчивости молекулы к воздействию УФ света. Облучение практически не влияло на окисление ДГФК (Ф = 0,008 ± 0,005).

В кислой среде (рН 2,7) в присутствии кислорода квантовый выход продуктов фотодеструкции ТГФК (Ф = 0,005 ± 0,005) был на порядок ниже, чем при рН 7,0 (Ф = 0,075 ± 0,005) (рис. 10). Повышение в кислой среде устойчивости ТГФК к окислению молекулы кислородом воздуха обусловлено протонированием по N5 положению птеринового кольца, что препятствует присоединению кислорода в С4а положение из-за электроноакцепторных свойств образующейся положительно заряженной аминогруппы (Pfleiderer, 1978; Пюльман и Пюльман, 1965). На примере модельного соединения 6,7- диметилтетрагидроптерина, показано, что при рН < 3,0, когда молекула протонируется по пятому положению птеринового кольца, это соединение устойчиво к фотоокислению кислородом воздуха, тогда как при нейтральных рН (pH > 4,0) свет ускоряет процесс окисления (Людникова и др., 2009).

Ф = 0, облучение темновой Рис. 9. Влияние УФ-излучения ( 290 ± 20 нм) на деградацию ДГФК, ТГФК и 5-формилТГФК в 0,05 М калийфосфатном буфере (рН 7,0) в присутствии и в отсутствие кислорода воздуха (деструкция в процентах от исходного количества по данным спектрофотометрии и спектрофлуориФ = 0,008 Ф = 0,Ф = 0,Ф = 0,метрии).

Ф = 0,вакуум воздух вакуум воздух вакуум воздух ДГФК ТГФК 5-формил-ТГФК На рис. 10 для сравнения приведены квантовые выходы фотолиза 5,10метенил-ТГФК (рН 2,7) в присутствии кислорода и в анаэробных условиях. По сравнению с квантовым выходом фотолиза ТГФК в нейтральных условиях (условия работы этого кофермента в клетках) квантовый выход продуктов фотодеградации 5,10-метенил-ТГФК (рН 2,7 - условия, сравнимые с условиями работы этого кофермента в составе белков) очень незначительный, что говорит о ее высокой устойчивости к УФ облучению по сравнению с ТГФК. Далее мы изучили вопросы, связанные с фотоустойчивостью 5,10-метенил-ТГФК.

Ф 0,0,Рис. 10. Кажущиеся интеграль рН 2,ные квантовые выходы продук рН 7,0,06 тов фотодеградации ТГФК и 5,10-метенил-ТГФК в 0,05 М калий-фосфатном буфере рН 2,и 7,0 (облучение 10 мин в мак0,симумах поглощения: 300 ± нм, 0,4 Вт·м-2) для ТГФК и ± 40 нм (20 Вт·м-2) для 5,100,0,метенил-ТГФК.

0,0,Ф < 0,001 Ф < 0,0,вакуум воздух вакуум воздух ТГФК 5,10-метенил-ТГФК Деструкция, % от исходного Фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК.

Структура 5,10-метенил-ТГФК в растворах сохраняется только при низких значениях pH 3,0. В белках эту структуру стабилизируют карбоксильные группы дикарбоновых аминокислот и –SH группа цистеина в сайте связывания 5,10-метенил-ТГФК (Huang et al., 2006). Повышение рН раствора приводит к разрыву имидазолинового цикла и трансформации 5,10-метенил-ТГФК в 5формил-ТГФК или 10-формилТГФК. После 30 минут инкубации 5х10-5 М раствора 5,10-метенил-ТГФК (рН 2,7) без облучения вне зависимости от доступа кислорода, деградация 5,10-метенил-ТГФК практически не проходила. В условиях УФ-облучения с интенсивностью 0,4 ± 0,2 Вт·м-2 5,10-метенил-ТГФК также проявляла стопроцентную сохранность вне зависимости от доступа кислорода. Поскольку в отличие от ТГФК, облучение такой мощности оказалось недостаточно эффективно для фотодеградации 5,10-метенил-ТГФК, исследование её фотодеградации далее проводили, используя в 50 раз более высокую интенсивность света (до 20 Вт·м-2). После УФ облучения ( 350 ± 40 нм) в течение 100 0.А 0.1.-0.-0.-0.300 400 нм 0.0.00 0.05 0.10 0.15 0.Ионная сила раствора (Iс), моль·л-0.300 400 500 нм облучениедеаэрированных растворов облучение растворов на воздухе исходный, без облучения, без облучения на воздухе, деаэрированный Рис. 12. Устойчивость 5,10-метенилРис. 11. Зависимость фотодеградации ТГФК (5х10-5 М) в муравьиной кислоте 5,10-метенил-ТГФК (5х10-5 М) от ионной рН 2,7 (Ic = 0,184 моль·л-1) при облучесилы раствора муравьиной кислоты (рН 2,7) при облучении ( 350 ± 40 нм) в тече- нии ( 350 ± 40 нм, 20 Вт·м-2) в течение 30 мин. На вставке разностные спектры ние 30 мин, с интенсивностью 20 Вт·м-2.

«свет минус темнота».

мин деаэрированного раствора 5,10-метенил-ТГФК в 0,002 М HCl или в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 2,7 в обоих случаях) оптическая плотность в максимуме поглощения при 360 нм снижалась на 5 - 6 % (k = 2,0х10-3 мин-1), тогда как в условиях аэрации на 3 - 4 % (k = 1,3х10-3 мин-1). ВЭЖХ анализ подтвердил, что фотоповреждение молекул 5,10-метенил-ТГФК проходит более интенсивно в деаэрированных растворах.

5,10-метенил-ТГФК, % Наглядно подавляющее влияние аэрации на фотодеградационный процесс проявилось при исследовании фотолиза 5,10-метенил-ТГФК в растворах формиата натрия различной ионной силы (Iс) при неизменном значении рН растворов, равном 2,7. В условиях повышенной ионной силы (0,184 моль·л-1), скорость фотолиза в деаэрированном растворе была в два раза выше, чем на воздухе (k = 8,7х10-3 мин-1 и 3,5х10-3 мин-1, соответственно) (рис. 11). Возрастание в облученных деаэрированных растворах поглощения при 300 нм (рис. 12, вставка), а также появление интенсивной флуоресценции с эмиссией при 360 нм после возбуждения при 300 нм, указывало на образование в ходе фотолиза ТГФК (рис. 13).

С помощью ВЭЖХ в аэрированных и деаэрированных растворах после облучения (рис. 14) идентифицированы 10-формил-ДГФК, 10-формил-ФК, а также обнаружены продукты расщепления - ПАБГ и неконъюгированные птерины. При этом в деаэрированных растворах количество ПАБГ и птеринов значительно превышало их количество в растворах, облученных на воздухе. Среди продуктов фотолиза в условиях деаэрации дополнительно обнаружена ДГФК, mV А 80 Птерины А10 5,10-Метенил-ТГФК 5,10-метенил-ТГФК ПАБГ исходный 500 ДГФК 10-формил-ДГФК 10-формил-ФК Б 0 5 10 15 20 на воздухе мин mV Б 350 5,10-метенил-ТГФК ТГФК 10-формил-ДГФК В Птерины ПАБГ 10-формил-ФК деаэрация 0 5 10 15 20 мин Рис. 13. Двумерные спектры флуоресцен- Рис. 14. Профили элюции продуктов фотолиза 5,10-метенил-ТГФК (5х10-5 М) в ции 5х10-5 М раствора 5,10-метенил-ТГФК в муравьиной кислоте, рН 2,7. А - до об- растворе 5 % муравьиной кислоты рН 2,7, ионная сила раствора 0,184 моль·л-1. Раслучения, Б и В - после облучения ( 350 ± твор облучали ( 350 ± 40 нм) в течение 40 нм, интенсивность 20 Вт·м-2) в течение 30 мин, интенсивность 20 Вт·м-2. А - для 30 мин в аэрированном и деаэрированном деаэрированного образца, Б - для образца растворах.

на воздухе.

и и ц н е ц с е р о у л ф е Ф и л н у е о р д е ж с у ц е б н з ц о и в я и и ц н е ц с е р о у л Ф ф л е у о и р н е с ц де е ж н ц у и б я з о в и и ц н е ц с е р о у л ф Ф е л и у о н р е де с ц ж е у н б ц з и я о в присутствие которой мы интерпретируем как результат окисления в ходе подготовки проб к анализу молекул ТГФК, образовавшихся при фотолизе. Различие продуктов фотолиза и скорости фотодеградции 5,10-метенил-ТГФК в аэрированных и деаэрированных растворах отражает различие химических механизмов её фотодеструкции.

Аппроксимируя данные по фотоустойчивости 5,10-метенил-ТГФК к условиям близким к природным по ионной силе и интенсивности УФА-излучения (1 Вт·м-2), можно заключить, что 5,10-метенил-ТГФК обладает достаточно высокой фотоустойчивостью, особенно в присутствии кислорода, и это представляет интерес в плане анализа фотобиологических функций этого кофермента в организмах.

Суммируя полученные данные по фотохимии коферментных производных фолиевой кислоты (рис. 15), можно заключить, что УФ облучение оказывает влияние на ряд процессов их взаимопревращения, которые могут происходить в живых организмах.

7,8-ДГФК h h -2e -2H, О-2e -2H, О2 NH NH NH H H N N N CH2 CH2 CH6 h h 7 N N N +2e +2H, +2e +2H, H H анаэроб анаэроб ФК ТГФК 5,8-ДГФК h деформилирование h формилирование Iс > 0,1 М, вакуум НСООН HC N CHO NH + CHN N CH2 Н+ N ОН- h N H H 5-формил-ТГФК 5,10-метенил-ТГФК Рис. 15. Влияние УФ облучения на взаимопревращения коферментных производных фолиевой кислоты.

Коферментные производные фолиевой кислоты в эволюции биологических рецепторов света.

5,10-Метенил-ТГФК функционирует в ДНК-фотолиазах и в криптохромах в качестве антенного пигмента, т.е. энергия его возбужденного состояния мигрирует на флавин реакционного центра, индуцируя, тем самым, химическую активность флавина. Возникает вопрос: как можно объяснить эволюционный отбор соединения, выполняющего важнейшие коферментные функции в «темновом» метаболизме, для выполнения специфической фотосенсорной функции в белках Анализ свойств 5,10-метенил-ТГФК, в том числе установленных в данной работе, указывает на уникальность фотохимических характеристик этого соединения по сравнению с другими коферментными производными ФК.

Выполнение 5,10-метенил-ТГФК антенной функции обусловлено уникальным сочетанием в молекуле высокой способности поглощать фотоны (max = 25000 моль-1 ·см-1) в физиологически приемлемом диапазоне спектра (max = 360 нм) с высокой фотохимической стабильностью. Определенный вклад в стабилизацию химической структуры 5,10-метенил-ТГФК вносит также взаимодействие с апобелком в сайте связывания, осуществляющееся за счет дикарбоновых аминокислот и цистеина. Высокая фотон-поглощающая способность на границе UV-A и видимой области, как и высокая устойчивость к фотолизу в присутствии кислорода, отличают 5,10-метенил-ТГФК от тетрагидрофолиевой кислоты и других ее одноуглеродных производных.

Имидазолиновый цикл, придавая жесткость структуре молекулы, обеспечивает эффективную передачу энергии возбуждения на другие молекулы (антенная функция). Можно думать, что эти структурные особенности молекулы сыграли роль селективных факторов при отборе 5,10-метенил-ТГФК на роль фотосенсора в светочувствительных белках.

Фотохимические реакции фолатов как элемент новой технологии получения кальция фолината.

Результаты исследования фотохимических свойств фолатов использованы при разработке технологии получения кальция фолината. Этот препарат, кальциевая соль 5-формил-ТГФК, неизменно входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств, утверждаемый Правительством Российской Федерации (последнее Распоряжение Правительства РФ от марта 2007 г. за № 376-р). Его широко используют при химиотерапии онкозаболеваний как антидот токсичных цитостатиков, а также для снятия токсических эффектов сульфаниламидов при лечении ревматоидных артритов и протозойных инфекций, например, токсоплазмозов у ВИЧ-инфицированных пациентов и при осложнениях беременности. Кальция фолинат эффективен при лечении ряда анемий, в том числе пострадиационных. За рубежом начато его применение как высокоэффективного витаминного препарата.

В настоящее время промышленное получение кальция фолината базируется на химическом восстановлении ФК в ТГФК в присутствии избытка боргидрида натрия. Далее, проводят формилирование ТГФК муравьиной кислотой и образовавшуюся 5,10-метенил-ТГФК посредством гидролиза в присутствии триэтиламина трансформируют в 5-формил-ТГФК (фолиновую кислоту), которую выделяют в виде кальциевой соли.

Установленное в работе превращение ФК в ТГФК путем фотовосстановления, а также возможность проводить (в присутствии муравьиной кислоты) параллельно с фотовосстановлением присоединение к молекуле ТГФК одноуглеродного фрагмента с образованием 5,10-метенил-ТГФК, побудили нас использовать фотохимические реакции для совершенствования технологии получения кальция фолината. Предложено два варианта использования фотохимического процесса.

Первый вариант включает активацию ультрафиолетом молекул ФК в процессе восстановления, что позволило повысить выход ТГФК и в два раза снизить концентрацию экологически вредного боргидрида натрия по сравнению с существовавшими методами.

Второй вариант предусматривает синтез 5,10-метенил-ТГФК из ФК не в две, а в одну стадию. Для этого фотовосстановление ФК проводится непосредственно в растворе муравьиной кислоты и донора электрона (исследовали НАД-Н и ЭДТА). Достоинства метода очевидны - сокращение технологического процесса и полный отказ от экологически небезопасного боргидрида натрия.

Данный вариант рассматривается сегодня, как ориентированный на перспективу и нуждается в проведении дополнительных исследований с целью повышения выхода 5,10-метенил-ТГФК, пока не отвечающего современным требованиям (достигнут выход только 15 %).

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»