WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

ДГФК 0.250 300 350 400 0 10 20 30 40 50, нм время удерживания, мин Рис. 2. Изменение спектра поглощения Рис. 3. ВЭЖХ хроматограммы реакционной смеси 5х10-5 М ФК, 5х10-3 М продуктов фотовосстановления ФК, ЭДТА в 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7 детектирование при 300 нм. А – при облучении УФ-светом ( 350 ± 40 нм) в без облучения, Б - после облучения условиях деаэрации. На вставке: разностный УФ-светом ( 350 ± 40 нм) в спектр "свет минус темнота". течение одного часа.

Облучение растворов ФК в диапазоне 280 - 390 нм, т.е. в области, захватывающей коротковолновый максимум поглощения ФК ( 280 нм), отличающийся высоким значением молярного коэффициента экстинкции (макс = моль-1 ·см-1 вместо 7000 моль-1 ·см-1 при 350 нм) приводило к тому, что уже после 40 мин облучения количество молекул ФК, разложившихся с образованием ПАБГ, в полтора раза превышало их количество при облучении светом 310 - 390 нм. Образование ДГФК при этом не увеличилось. Следовательно, возбуждение ФК в коротковолновом максимуме ( 280 нм) ускоряет деградацию фолатов.

Помимо ЭДТА (Ео = +0,40 В), в качестве доноров электрона для фотовосстановления ФК исследовали соединения с более отрицательными значениями электродного потенциала НАД-Н (Ео = -0,32 В) и боргидрид натрия (Ео = -0,48 В или -1,24 В, в зависимости от условий восстановления).

НАД-Н является природным донором электрона и протона в реакциях темнового ферментативного восстановления ФК и ДГФК. В его присутствии возбуждение в области 310 - 390 нм индуцировало в растворах ФК спектральные изменения, указывающие на присутствие ДГФК и ТГФК. Образование в фотореакции ТГФК подтвердили спектрофлуориметрические измерения, выявившие наличие в продуктах реакции характерной для ТГФК флуоресценции с возб = 295 нм и эм = 360 нм. Следует учитывать, что образование восстановленных форм ФК могло быть результатом фотохимической активности не только фолатов, но и НАД-Н (Красновский и др., 1980, Никандров и Красновский, 1978). В присутствии НАД-Н, донора с более отрицательным значением Ео по сравнению с ЭДТА возрастала начальная скорость фотовосстановления и повышался выход продуктов (табл. 1).

В отличие от рассмотренных выше доноров электрона боргидрид (сильный восстановитель и антиоксидант) способен восстанавливать ФК и в отсутствие облучения. Поэтому, одной из задач было выяснить, влияет ли ультрафиолет на скорость образования и выход ДГФК и ТГФК. Чтобы минимизировать темновое восстановление ФК, концентрация боргидрида в опытных пробах была в два раза ниже концентрации фолата. При этом количество восстановительных эквивалентов и фолата было эквимолярным (по 4 на каждую молекулу ФК). Во время облучения водного раствора ФК, содержавшего незначительное количество (10-5 М) боргидрида, рН не поднимался выше 7,5 - 8,0 и, следовательно, разложение боргидрида с высвобождением электронов и водорода проходило по уравнению:

ВН4 + 3Н2О = В(ОН)3 + 7Н+ + 8 Ео = - 0,48 В В этих условиях восстановление ФК при отсутствии облучения не происходило. Облучение растворов в течение 10 мин приводило к падению поглощения в длинноволновом максимуме ФК при 350 нм и возрастанию поглощения при 282 нм и 310 нм, характерных для ДГФК и ТГФК. Сохранность очень лабильной ТГФК в данных условиях обеспечивал мощнейший антиоксидант NaBH4.

Таким образом, при использовании низкой концентрации боргидрида, удалось показать возможность фотовосстановления ФК до дигидро- и тетрагидроформ.

При восстановлении ФК (10-4 М) избытком боргидрида 7,5х10-2 М (эта концентрация близка к концентрации других доноров электрона – ЭДТА и НАД-Н) имел место другой характер процесса восстановления ФК по сравнению с восстановлением в нейтральной среде. При таком избытке восстановителя рН раствора равен 9,5 и наблюдается совсем другой характер разложения боргидрида:

ВН4 + 8ОН = Н2ВО3 + 5Н2О + 8е Ео = - 1,24 В В данных условиях восстановление ФК происходило и в отсутствие облучения с образованием ТГФК. В этом случае ультрафиолет может ускорять протекание реакции восстановления. Как видно из двумерных спектров флуоресценции, количество ТГФК (возб = 300 нм, эм = 360 нм) в облученных образцах (выход 45 ± 5 %) в полтора раза больше, чем без облучения (выход 30 ± 5 %) (рис. 5).

Облучение Без облучения АБ ТГФК ТГФК 400 Рис. 5 Флуоресценция продуктов восстановления ФК (10-4 М) с боргидридом натрия (7,5х10-2 М) в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 9,5). А - После облучения ( 350 ± 40 нм) в течение 20 мин, Б – Контроль без облучения.

Исследование процесса фотовосстановления ФК в присутствии разных доноров электрона показало, что его эффективность, т.е. начальная скорость реакции и выход продуктов восстановления, возрастают с понижением значения электродного потенциала донора электрона (табл. 1).

Таблица 1. Эффективность доноров электрона при фотовосстановлении ФК Донор Ео, В k, мин-1 Продукты Выход электрона продуктов*, % ЭДТА +0,40 0,010 ± 0,005 ДГФК 5 ± НАД-Н -0,32 0,063 ± 0,011 ДГФК и ТГФК 15 ± Боргидрид** -0,48 0,087 ± 0,017 ДГФК и ТГФК 23 ± * - максимальный выход восстановленных форм ФК в данных условиях ** - в случае эквимолярного количества восстановительных эквивалентов и фолата Таким образом, можно заключить, что фотовозбужденная ФК (в разбавленных нейтральных растворах) способна окислять донор электрона с образованием восстановленных форм ДГФК и ТГФК.

Формилирование как методический подход для идентификации ТГФК в продуктах фотовосстановления.

Быстрое окисление ТГФК кислородом воздуха затрудняло ее хроматографическую регистрацию методом ВЭЖХ в продуктах фотовосстановления и количественную оценку ее выхода. Это затруднение можно было обойти, используя химическую ловушку, т.е. реакцию, трансформирующую ТГФК в более стабильное производное. В качестве такой ловушки мы использовали формилирование ТГФК муравьиной кислотой, приводящее к образованию 5,10Интенсивность е Ф и л н е у е Ф о и д р л н е у ж е с о у д ц р е б е ж н з с у ц ц и б е з я Во н ц о и В я метенил-ТГФК (рис. 1), отличающейся высокой стабильностью в кислой среде (Rabinowitz, 1963). Формилирование с целью перевода ТГФК в 5,10-метенилТГФК исследовано нами как отдельная реакция, а также в рамках процесса, сопряженного с фотовосстановлением фолата.

Как отдельная реакция данный методический прием использовался при анализе продуктов восстановления ФК с избытком боргидрида. Формилирование продуктов восстановления проводили, добавляя к пробам после инкубации муравьиную кислоту до концентрации 50 % (рН 1,1) и оставляя их в темноте под аргоном на ночь. ВЭЖХ анализ продуктов формилирования показал, что выход 5,10-метенил-ТГФК в расчёте на исходную ФК составил 26 ± 2% для опытов без облучения и 38 ± 2 % для восстановления под воздействием УФоблучения.

Второй вариант использования химической ловушки для ТГФК применили в опытах с ЭДТА и НАД-Н. При этом процесс фотовосстановления ФК проводили в среде муравьиной кислоты. В случае с ЭДТА концентрация муравьиной кислоты была 30 % (рН 1,5) и выход 5,10-метенил-ТГФК был очень незначительным (3 ± 1 %). Мы полагаем, что такой невысокий процент выхода 5,10метенил-ТГФК, помимо высокого потенциала донора электрона, объясняется тем, что в присутствии муравьиной кислоты в исходной реакционной смеси происходит конкурентное формилирование исходной ФК. Наличие же формильного заместителя может быть причиной затруднений при взаимодействии молекул образующейся при этом 10-формил-ФК и ЭДТА из-за образования водородных связей между ними. Это было доказано в экспериментах по облучению 10-формил-ФК с ЭДТА в качестве донора электрона, в которых фотовосстановление 10-формил-ФК не происходило.

В случае фотовосстановления ФК с НАД-Н в присутствии муравьиной кислоты в опыт брали 10 - 15 % муравьиную кислоту (рН < 2,0), чтобы обеспечить достаточное количество формиат-иона, но, учитывая лабильность НАД-Н в кислой среде, перед облучением рН реакционной смеси доводили до трех. Деаэрированные опытные растворы, содержащие ФК и НАД-Н, облучали УФА mV ( ) - облучение 10 мин;

Б А A ( ) - облучение 20 мин;

5,10-метенил-ТГФК ( ) - облучение 30 мин;

0.( ) - после добавления муравьиной кислоты до 50 %.

0.0 3 6 9мин 0.Рис. 6. А - Разностный спектр поглощения "свет минус темнота" реакционной смеси (10-4 М ФК и 10--0.М НАД-Н в 15 % муравьиной кислоте, доведенной до рН 3,0) при облучении УФ ( 350 ± 40 нм). Б - ВЭЖХ нм 300 350 продуктов реакции фотохимического синтеза.

светом ( 350 ± 40 нм) (рис.6, А). По окончании процесса фотовосстановления, концентрацию муравьиной кислоты доводили до 50 % и выдерживали смесь в темноте для завершения процесса формилирования с образованием 5,10метенил-ТГФК.

По спектральным данным рассчитали, что выход 5,10-метенил-ТГФК (в расчете на исходную ФК) равен 26 ± 2 %. Эти данные были подтверждены ВЭЖХ анализом (рис. 6, Б). Сравнение этих данных с данными по фотовосстановлению ФК с НАД-Н в нейтральной среде, когда выход достигал только 15 ± 2 %, говорит о том, что повышение выхода восстановленных форм ФК можно достичь переводом образующейся ТГФК в устойчивое соединение, каковым является 5,10-метенил-ТГФК.

Таким образом, фотовосстановление ФК в растворе муравьиной кислоты приводит к образованию тетрагидровосстановленной коферментной формы ФК - 5,10-метенил-ТГФК, и данный методический прием может быть использован для подтверждения образования ТГФК в исследуемых фотопроцессах.

С целью выяснения механизма фотовосстановления ФК до ТГФК, было исследовано фотовосстановление ДГФК. Показано, что в присутствии донора электрона - ЭДТА облучение ультрафиолетом в области 300 - 340 нм раствора дигидоформы ФК (исследовали устойчивую 7,8-ДГФК) образование ТГФК не наблюдали. Это может указывать на то, что при фотовосстановлении ФК до ТГФК интермедиатом может служить более активная и менее стабильная 5,8дигидроформа (Kwee and Lund, 1979).

Участие свободных радикалов в фотовосстановлении фолиевой кислоты.

Отсутствие сведений о связи свободнорадикальных механизмов с процессом фотовосстановления фолатов побудило нас исследовать способность возбужденных птериновых молекул генерировать свободные радикалы. Для регистрации свободных радикалов ФК, а также неконъюгированых птеринов (6метилптерина и 6,7-диметилптерина) использовали метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Фотовозбуждение ( 320 - 390 нм) замороженных водно-спиртовых (v/v 1:2) растворов этих соединений (10-2 М) в присутствии донора электрона (цистеин, аскорбат, ЭДТА в концентрации 10-2 М или в насыщающей концентрации) приводило к генерации радикалов, которые регистрировали по спектрам ЭПР, имевшим вид синглетной линии полушириной Эрстед со слаборазрешенной сверхтонкой структурой с g = 2,0031 (рис. 7, А).

Образование радикалов проходило более активно при использовании аскорбата либо цистеина в качестве донора электрона по сравнению с ЭДТА.

Анализ кинетики изменения сигнала ЭПР показал, что возбуждение молекул ФК и птеринов в присутствии донора при 163 К сопровождалось накоплением свободных радикалов, сохранявших устойчивость при этой температуре. При повышении температуры до 183 К происходила деградация радикалов, о чем свидетельствовало снижение интенсивности и, далее, исчезновение сигI, отн. един.

А Б 163 К Облучение Без облучения 6,7-Диметилптерин Фолиевая кислота 163 К 183 К 10 20 30 40мин Рис. 7. А – Спектр ЭПР 10-2 М 6,7-ДМП и ФК в растворе (вода-этанол 1:1) с цистеином (насыщающая концентрация), облученного в резонаторе радиоспектрометра ксеноновой лампой ДКСШ-200 (облучение в ампуле в диапазоне от 320 до 400 нм) при 163 К; Б – влияние температуры на изменение во времени интенсивности сигнала ЭПР (I, отн. ед.) при облучении и в его отсутствие.

нала (рис. 7, Б).

Начальная скорость фотовосстановления птеринов коррелировала с интенсивностью сигнала ЭПР. Так, более высокой интенсивности сигнала ЭПР для фотовозбужденного 6,7-диметилптерина по сравнению с ФК соответствовала более высокая скорость фотовосстановления этого птерина (k = 0,03 мин-1) по сравнению с ФК (k = 0,01 мин-1).

Таким образом, показана способность возбужденных птеринов, в том числе фолиевой кислоты, генерировать свободные радикалы, а корреляции между активностью радикалов и скоростью восстановления указывают на свободнорадикальный механизм этого фотохимического процесса.

Исследование влияния УФ-облучения на трансформацию одноуглеродных производных фолатов.

Для формирования представлений о фотохимических свойствах фолатов важно было выяснить, влияет ли возбуждение их молекул на ковалентное связывание одноуглеродных фрагментов, а также последующую трансформацию этих производных. С этой целью исследовано влияние УФ-облучения на процесс формилирования ТГФК, а также превращение 5,10-метенил-ТГФК в 5формил-ТГФК (рис. 1).

Формилирование ТГФК с образованием 5,10-метенил-ТГФК.

Для изучения влияния УФ-облучения ( 300 ± 20 нм) на процесс формилирования раствор ТГФК (3х10-5 М) в 5 или 50 % муравьиной кислоте, содержавший антиоксидант дитиотреитол (5х10-3 М), облучали в течение 20 минут.

За это время, как в темноте, так и при облучении образовывалось 1,5 ± 0,5 % и 12,0 ± 1,0 % 5,10-метенил-ТГФК в 5 и 50 % муравьиной кислоте, соответственно. Из этого можно заключить, что свет не влияет на процесс формилирования ТГФК.

Превращение 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК.

В метаболизме фолатов 5,10-метенил-ТГФК может превращаться в термодинамически устойчивую 5-формил-ТГФК, выполняющую резервные функции. Данное соединение используется также в качестве лекарственного средства. Вопрос о том, влияет ли свет на процесс превращения 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК, представляет интерес не только в плане фундаментального изучения фотохимических свойств фолатов, но и в связи с лекарственным применением 5-формил-ТГФК.

Изучение влияния ультрафиолета ( 350 ± 40 нм) и температуры на переход 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК проводили при рН 4,5, чтобы исключить превращение 5,10-метенил-ТГФК в 10-формил-ТГФК, происходящее при рН 6,0. В темноте, в условиях аэрации в разбавленном растворе (5х10-5 М, в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 4,5), около пятнадцати процентов 5,10метенил-ТГФК превращалось в 5-формил-ТГФК. При этом около 10 ± 2 % исходного вещества подвергалось разложению. Методами спектрофотометрии и ВЭЖХ показано, что облучение практически не влияло на скорость перехода и выход 5-формил-ТГФК, как в условиях аэрации, так и в отсутствие кислорода.

Эффективным способом превращения 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК оказалось температурное воздействие. Инкубация 5,10-метенил-ТГФК в деаэрированном растворе (рН 4,5) при 50 оС в течение одного часа приводила к превращению 30 ± 4 % 5,10-метенил-ТГФК в 5-формил-ТГФК вместо 15 ± 3 % при комнатной температуре.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»