WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
на правах рукописи ВЕЧТОМОВА ЮЛИЯ ЛЕОНАРДОВНА ФОТОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ КОФЕРМЕНТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, Т. А. Телегина Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. Я. Потапенко доктор биологических наук Н. А. Чеботарева Ведущая организация:

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Защита состоится «18» июня 2009 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «» 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Фолиевая кислота (ФК, птероил-L-глутаминовая кислота, витамин Bc или B9) составляет структурную основу коферментов, обязательных участников переноса и трансформации одноуглеродных (метильных и формильных) групп в биосинтезе нуклеотидов и аминокислот. Фолиевая кислота, а в последнее время также некоторые её коферментные производные, например, фолиновая (5-формилтетрагидрофолиевая) кислота, используются в качестве витаминных препаратов. Обладающие цитостатическим действием антиметаболиты фолатов (метотрексат и др.) широко применяют в терапии онкозаболеваний (Андреева и др., 1982, Calabr and Sternber, 2007).

Характеристика фотохимических свойств фолатов представляет интерес для ряда областей фотобиологии и фотомедицины, например, для формирования представлений о молекулярных мишенях воздействия УФ-излучения на организм. Вместе с тем, информация относительно этих свойств фолатов, как и других биологических птеринов, до последнего времени носила фрагментарный характер. Лишь сравнительно недавно обнаружено, что возбужденные состояния окисленных и дигидроформ неконъюгированных птеринов (т.е. птеринов, имеющих короткий заместитель в положении С6) могут окислять молекулы доноров электрона и превращаться в более восстановленные формы (Kritsky et al., 1997). Для фолиевой кислоты и ее производных подобные реакции известны не были, а автоматический перенос на фолаты сведений, накопленных при изучении неконъюгированных птеринов, был некорректен, поскольку наличие у фолатов в положении С6 гетероцикла объемного п-аминобензоилглутаминового заместителя существенно модифицирует их свойства по сравнению с неконъюгированными птеринами (Cabrerizo et al., 2005, Thomas et al., 2002).

Таким образом, возникла необходимость исследования фотохимических свойств ФК, в частности, способности ее фотовосстановления. Можно было ожидать, что результаты такого исследования будут полезны для совершенствования технологий синтеза лекарств на основе фолатов.

Еще одно обстоятельство, определяющее интерес к фолатам как объектам фотобиохимического исследования - это участие одного из коферментов - 5,10метенилтетрагидрофолиевой кислоты (5,10-метенил-ТГФК) в физиологической ФК, фолиевая кислота; ТГФК, 5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота; ДГФК, дигидрофолиевая кислота; ПАБГ, п-аминобензоилглутаминовая кислота; ЭДТА, Na2-этилендиаминтетрауксусная кислота; НАД-H, никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма; ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография; 5,10-метенил-ТГФК, 5,10-метенилтетрагидрофолиевая кислота; 5-формил-ТГФК, 5-формилтетрагидрофолиевая кислота; Ф, квантовый выход продуктов реакции.

рецепции света. 5,10-Метенил-ТГФК входит в состав ДНК-фотолиаз, ферментов, катализирующих фоторепарацию поврежденной ультрафиолетом ДНК.

Кроме того, данное соединение обнаружено в качестве хромофора белков одного из семейств рецепторов синего света – криптохромов. Эти фоторецепторы участвуют в регуляции светозависимых процессов онтогенеза у растений, а также, по-видимому, осуществляют контроль над проявлением циркадных ритмов у высших эукариот. В составе белков - рецепторов света фотовозбужденная 5,10-метенил-ТГФК непосредственно не вступает в химические реакции, а функционирует как светосборщик, энергия возбуждения которого передается на молекулу флавина, выполняющего в активном центре роль редокс агента (Sancar, 2003). Важным условием осуществления такой «антенной» функции является химическая стабильность молекулы при воздействии на нее света. Несмотря на то, что данное свойство молекулы могло иметь серьезное значение для эволюционного отбора, ранее не предпринималось попыток исследовать фотоустойчивость 5,10-метенил-ТГФК и сопоставить ее с фотоустойчивостью других фолатных коферментов.

Таким образом, по своей проблематике диссертационное исследование ориентировано на решение ряда актуальных задач биохимии. Среди этих задач – исследование свойств фотовозбужденных молекул фолатных коферментов, которые могут функционировать как низкомолекулярные биорегуляторы, а также формирование представлений о химических основах биологической рецепции света и воздействии на организм ультрафиолетового излучения.

Цель и задачи исследования.

Цель диссертационной работы – исследование фотохимических свойств фолиевой кислоты и ее коферментных производных, использование полученных результатов для развития представлений об эволюции фоторецепторов УФА-излучения, а также для совершенствования метода получения лекарственного средства – кальция фолината.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить процессы образования восстановленных форм фолиевой кислоты под действием ультрафиолетового излучения.

2. Исследовать фотоустойчивость восстановленных форм фолатов. Выявить связь фотохимических свойств 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты с ее эволюционным отбором на роль антенны УФ-А света в фоторецепторных белках (в фотолиазах и криптохромах).

3. Изучить влияние УФ-облучения на формилирование тетрагидрофолиевой кислоты и переход 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты в 5формилтетрагидрофолиевую кислоту.

4. Использовать полученные данные при разработке способа получения лекарственного средства – кальция фолината (кальциевой соли 5формилтетрагидрофолиевой кислоты).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Возбужденная УФА-излучением фолиевая кислота может взаимодействовать с различными донорами электрона с образованием дигидрофолиевой и тетрагидрофолиевой кислот (ДГФК и ТГФК). Фотовосстановление фолиевой кислоты, а также других биологических птеринов, протекает по свободнорадикальному механизму. Фотохимическое восстановление фолиевой кислоты в присутствии муравьиной кислоты ведет к образованию 5,10-метенил-ТГФК.

2. УФА-излучение в присутствии кислорода воздуха усиливает фотоокисление тетрагидрофолиевой кислоты и практически не влияет на устойчивость к окислению 5,10-метенил-ТГФК в условиях близких к природным.

3. Результаты исследования фолиевой кислоты и ее коферментных производных позволяют усовершенствовать технологию получения фолината кальция.

Научная новизна. Впервые проведено фотовосстановление фолиевой кислоты с образованием дигидрофолиевой и тетрагидрофолиевой кислот, а в присутствии муравьиной кислоты - с образованием кофермента 5,10-метенил-ТГФК. На основании изучения свойств свободных радикалов, образующихся в исследуемых системах, предложен свободнорадикальный механизм фотохимического синтеза ДГФК и ТГФК. Показана высокая устойчивость 5,10-метенил-ТГФК к УФА-облучению в присутствии кислорода, которая могла служить одним из факторов эволюционного отбора этого кофермента на роль фотоантенны в рецепторах УФА-света.

Научно-практическая ценность. На основании результатов исследования фотохимических свойств фолиевой кислоты и ее производных разработан новый способ получения лекарственного средства – кальция фолината (кальциевой соли 5-формил-ТГФК).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 13 научных конференциях в нашей стране и за рубежом. Лично автором диссертации они доложены на: XIV Зимней международной молодежной научной школе “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2002); Международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2003); V Съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» и VIII съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2008); 12th ISSOL Meeting and 15th International Conference on the Origin of Life (Флоренция, Италия, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах, 2 статьи в научных сборниках, 1 патент и 15 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания материалов и методов исследования (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (1 глава), выводов, приложения (_ страниц) и списка цитируемой литературы (_ источников). Диссертация изложена на _ страницах, содержит _ рисунков и _ таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

Установки для УФ-облучения образцов Источником излучения служил осветитель ОИ-18 с ртутной лампой среднего давления ДРК-120 или ртутная лампа ДРЛ-400, из спектра которых с помощью светофильтра УФС-6 выделяли область 310 - 390 нм ( 350 ± 40 нм), либо со светофильтром УФС-5 область 280 - 390 нм. Облучение также проводили в установке, состоящей из спектрофотометра СФ 2000 и источника возбуждающего света - ксеноновой лампы ДКсШ-150 с монохроматором. В опытах по фотовосстановлению и фотодеструкции восстановленных фолатов интенсивность облучения, падающего на образец (энергетическая освещенность), была одинаковой и составляла 0,4 ± 0,2 Вт·м-2. В некоторых опытах по фотодеструкции 5,10-метенил-ТГФК интенсивность света составляла 20 Вт·м-2 (ртутная лампа ДРЛ-400).

Анализ продуктов фотохимических реакций Для ВЭЖХ разделения продуктов реакций (хроматограф «Стайер» фирмы “Аквилон”, Россия) нами разработаны следующие методики: (1) Для анализа ТГФК и ДГФК использовали обращенно-фазную колонку Luna C18. Подвижная фаза содержала 2,5х10-2 М КН2РО4, рН 2,5 и 2,0х10-4 М унитиол, с градиентом ацетонитрила (5 % - 20 %). Детекцию этих соединений осуществляли по поглощению элюатов при 300 нм, а также по их флуоресценции.

(2) Содержание 5,10-метенил-ТГФК определяли на обращенно-фазной колонке Synergi Hydro-RP. Подвижная фаза содержала 5,0х10-2 М КН2РО4, рН 3,0 с 10 % ацетонитрила. Подвижную фазу перед началом и в процессе разделения насыщали аргоном. Соединения детектировали по поглощению элюата при двух длинах волн - 280 нм и 350 нм. (3) 5-формил-ТГФК идентифицировали на обращенно-фазных колонках Luna C18 и Synergi Hydro-RP в 5,0х10-2 М КН2РО4, рН 4,5 с 6 % ацетонитрила. Детекцию проводили по поглощению при 280 нм.

Количество фолиевой кислоты, разложившейся под действием света на птерин и п-аминобензоил-L-глутаминовую кислоту (ПАБГ), определяли по реакции азосочетания аминогруппы ПАБГ с N-(1-нафтил)этилендиаминдигидрохлоридом (Коренман, 1975).

Результаты и их обсуждение.

Возможность фотовосстановления фолатов представляет принципиальный интерес, в частности, в связи с изучением возможности образования под действием света восстановленных коферментных форм ФК. На рис. 1 представлены запланированные нами основные этапы работы по фотовосстановлению ФК до ДГФК и ТГФК и образованию восстановленных коферментных производных - 5,10-метенил-ТГФК и 5-формил-ТГФК.

Фотовосстановление ФК и влияние доноров электрона.

Фотовосстановление ФК исследовали в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0), деаэрированном продувкой аргоном или вакуумированием. При облучении УФ-светом ( 350 ± 40 нм) в течение одного часа раствора ФК (5х10-5 М), содержавшего ЭДТА (5х10-3 М), который широко используется как донор при исследовании фотохимии флавинов и птеринов, происходило выцветание полосы поглощения ФК с максимумом в области 350 нм и увеличивалось поглощение в области 280 320 нм, соответствующее поглощению восстановленных форм ФК (рис. 2). Эти изменения особенно наглядны в разностном спектре «свет минус темнота» (рис. 2, вставка). Такой характер изменения спектра поглощения указывал на образование ДГФК. Положение изобестической точки при 325 нм соответствовало превращению ФК в ДГФК. Константа начальной скорости (k) восстановления ФК в этих условиях составляла 0,010 ± 0,005 мин-1.

Без облучения изменений в спектре не происходило.

На фотовосстановление ФК указывало также появление характерной для ДГФК флуоресценции в области 425 нм (возб = 315 нм). ДГФК была идентифицирована в продуктах фотохимической реакции с помощью ВЭЖХ (рис. 3). Согласно результатам этого анализа, после одного часа облучения ее выход (в расчете на моль исходной ФК) составил 5 ± 2%.

3' 2' O O H4 4а N C N C N CHCOOH HN H H Фолиевая кислота 5' 6' CH(ФК) H2N N N 8 CHCOOH h Донор электрона и водорода 3' 2' O O HH N C N C N CHCOOH HN H H Дигидрофолиевая 5' 6' CHкислота (ДГФК) H2N N N CHH COOH Донор электрона и водорода h 3' 2' O O HH N C N C N CHCOOH HN H H Тетрагидрофолиевая 5' 6' CHкислота (ТГФК) H2N N N CHH COOH муравьиная кислота 3' 2' O HCOOO N C N CHCOOH H 5,10-метенил-ТГФК 5' 6' N+ CH2 CHHN CHH2N N N COOH H OH3' 2' CHOHO O N C N C CHCOOH N HN H H 5-формил-ТГФК 5' 6' CHH2N N N CHH COOH Рис.1. Предполагаемая последовательность этапов фотовосстановления ФК до ДГФК и ТГФК и образования восстановленных коферментных форм ФК: 5,10метенил-ТГФК и 5-формил-ТГФК.

При более продолжительном облучении длинноволновая полоса поглощения ФК полностью исчезала (рис. 2). Наряду с этим в течение второго часа облучения снижалась интенсивность коротковолнового максимума поглощения и его сдвиг в сторону 270 нм (270 нм - максимум поглощения ПАБГ). Это указывало на то, что параллельно с восстановлением ФК происходило разложение фолатов с образованием неконъюгированных птеринов и ПАБГ. Определение содержания ПАБГ в продуктах реакции подтвердило это предположение: после двух часов облучения 28 ± 2 % молекул исходной ФК разрушалось с образованием ПАБГ.

mV А без облучения A A 0.2 ФК 1.0.Обл. 1ч.

0.-0.-0.1.Обл. 2ч.

0 10 20 30 40 50 -0.время удерживания, мин -0.250 300 350 400 mV Б облучение, нм Исходный 0.ФК Облучение 1ч.

Облучение 2ч.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»