WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Это, однако, не означает, что тетрапирролы вообще не участвуют в передаче пластидного сигнала. Не исключено, что деградация Mg-Proto приводит к образованию побочных продуктов (например, АФК) или к сдвигу редокс-состояния ЭТЦ пластид, которые и могут выступать в качестве ретроградных сигналов. Кроме того, возможно побочное действие ингибиторов (НФ, ДП), поскольку эти гербициды влияют на различные биологические процессы в клетке, которые также могут участвовать в регуляции экспрессии ядерных генов. Несмотря на большое количество полученных данных, остается неясным, как нарушение метаболизма тетрапирролов может приводить к восстановлению транскрипции ELIP, и каков механизм передачи пластидного сигнала, Для того чтобы это выяснить, необходимы дальнейшие исследования.

2. Влияние других типов пластидных сигналов на экспрессию генов ELIP при нарушении биосинтеза тетрапирролов у hy и gun мутантов.

Для того чтобы изучить участие АФК, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии генов ELIP использовали ацифлуорфен, который ингибирует протопорфириноген-оксидазу (ППО) и приводит к образованию АФК (Matringe et al., 1989).

Обработка АФ растений дикого типа и gun5-1, hy1, hy2 мутантов Arabidopsis на разных стадиях их развития показала, что взрослые растения более АФ-толерантны, чем молодые растения, причем толерантность растений на HL выше, чем на LL. Была обнаружена также повышенная резистентность к АФ у молодых проростков gun5-1 мутантов, имеющих дефект в Н-субъединице Mg-хелатазы, что указывает на участие этого фермента в резистентности к гербициду.

С помощью ОТ-ПЦР было показано, что содержание транскриптов ELIP1 и ELIPбыло снижено у 30-дневных растений дикого типа, обработанных 50 µM ингибитора, и составляло всего около 30% и 15%, соответственно. Обработка 30 µM АФ приводила к снижению уровня экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 на ~ 50% и ~ 65%, соответственно (рис.

7А).

Рис. 7. Уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 у 30- (А) и 10-дневных (Б) растений Arabidopsis, обработанных АФ. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии у ДТ растений, который принимали за 100%.

Изучение экспрессии этих генов у молодых растений, развитие которых было подавлено гербицидом, показало, что экспрессия генов ELIP у 10-дневных проростков ДТ и hy мутантов, выращенных на АФ-среде, подавляется на 80-90%. У АФ-обработанных gun5-мутантов было обнаружено снижение экспрессии генов ELIP только ~ на 30% (рис. 7Б).

Таким образом, АФ влияет на экспрессию генов ELIP у растений Arabidopsis, причем увеличение концентрации АФ приводит к более сильному ингибированию экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. В основе этой регуляции, вероятно, лежит е накопление Proto, которое ведет к образованию АФК. По-видимому, можно говорить о негативной регуляции экспрессии генов ELIP пластидным сигналом с участием АФК. Однако нельзя исключить возможного побочного действия АФ, что может приводить к накоплению других соединений, которые также могут участвовать в экспрессии ядерных генов ELIP.

Для того чтобы изучить экспрессию ядерных генов ELIP1 и ELIP2 при накоплении интермедиатов биосинтеза тетрапирролов, в условиях, когда хлоропласты подвержены фотоокислению, была использована АЛК. При действии АЛК на HL избыточное накопление тетрапирролов в клетках приводит к индукции АФК (рис. 8). У мутантов с нарушенной передачей сигнала содержание транскриптов ELIP коррелирует с фотоокислением клеток и заметно ниже (10-20% от контроля), чем у растений дикого типа (60-80% от контроля) после воздействия АЛК (рис. 8).

Таким образом, можно предположить, что избыточное накопление тетрапирролов при действии АЛК на клетки растений приводит к индукции АФК, которые негативно регулируют экспрессию генов ELIP. Возможно, содержание тетрапирролов, вызывающих сильные фотодинамические повреждения, у АЛКобработанных gun мутантов превышает их содержание у растений дикого типа, или эти мутанты имеют более слабый механизм защиты от Рис. 8. ОТ-ПЦР анализ накопления транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 30окислительного стресса, что может являться дневных gun4, gun5-1 мутантов и причиной отличий в экспрессии генов ELIP у этих растений дикого типа (ДТ) Arabidopsis, инкубированных с растений.

мМ АЛК на HL (2 ч). UBQДля того чтобы изучить участие редоксиспользовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

состояния пула пластохинонов (ПП) пластид в регуляции экспрессии генов ELIP у растений ячменя и Arabidopsis были проведены опыты со специфическим ингибитором, блокирующим транспорт электронов от ФС2 к ПП, - диуроном. Этот ингибитор препятствует восстановлению пула пластохинонов и приводит к накоплению окисленных форм ПП.

Наши данные показали, что действие диурона приводит к снижению транскрипции генов ELIP и подавлению фотохимической активности ФС2 (Осипенкова и др., 2007).

Обработка растений ячменя диуроном с помощью опрыскивания приводила к снижению уровня транскрипции генов ELIP на 70-80%, с помощью инфильтрации - к значительному ингибированию (~ на 90%) экспрессии этих генов (рис. 9).

Нарушение биосинтеза тетрапирролов (у gun5 мутантов) не влияло на экспрессию генов ELIP при обработке диуроном. Фотохимическая активность ФС2 у 7-дневных растений ячменя, обработанных диуроном, была подавлена ~ на 30% (Осипенкова и др., 2007).

Рис. 9. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 у обработанных диуроном (+) и контрольных (-) растений ячменя и Arabidopsis. 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Таким образом, эти результаты подтверждают, что редокс-состояние пула пластохинонов хлоропластов может выступать в роли негативного пластидного сигнала при экспрессии генов ELIP у растений ячменя и Arabidopsis.

3. Влияние некоторых сигнальных систем клетки на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.

3.1. Действие пластидного сигнала при разной интенсивности света на экспрессию генов мультигенного семейства белков LHC: ELIP1, ELIP2 и Lhcb2 и экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов (HEMA1, HEMAи ChlH).

Был проведен анализ экспрессии генов стрессовых белков хлоропластов ELIP и близкородственного гена Lhcb2 с генами, кодирующими ферменты биосинтеза тетрапирролов (HEMA1, HEMA2 и ChlH) у hy и gun мутантов при разной интенсивности света, для того чтобы сравнить участие ретроградной регуляции и света в их экспрессии.

Изучение влияния пластидного сигнала на экспрессию Lhcb2, HEMAs и ChlH показало, что, в противоположность экспрессии генов ELIP, HY1 и HY2 пластидные сигналы участвуют в негативной регуляции экспрессии генов Lhcb2 и HEMA1, снижая ее (на 30-50%) и не влияют на экспрессию генов HEMA2 и ChlH (рис. 10).

Кроме того, GUN4 мутация, приводящая к активации экспрессии генов ELIP и подавлению экспрессии гена ChlH (~ на 50%) не влияла на экспрессию генов HEMAs и Lhcb2. Мутация GUN5-1 не влияла на экспрессию изученных генов, кроме гена ChlH, содержание транскриптов которого было понижено (на 70-80%) у gun5-1 мутантов.

Таким образом, экспрессия генов ELIP1 и ELIP2 регулируется пластидным сигналом противоположно генам Lhcb2, HEMA1 и ChlH. Пластидная регуляция не вовлечена в экспрессию генов HEMA2.

Было показано, что при увеличении интенсивности освещения уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 увеличивается (~ в 3 раза), а генов Lhcb2 и HEMA1 снижается (более чем вдвое). Световой сигнал не влияет на экспрессию генов HEMA2 и ChlH.

Таким образом, экспрессия генов ELIP зависит от интенсивности освещения, как и генов Lhcb2 и HEMA1, однако, эти гены регулируются противоположным образом.

Предполагали, что световой и пластидный сигналы тесно связаны:

пластидный сигнал может модулировать действие света и являться его эндогенным регулятором (Larkin and Ruckle, 2008).

Некоторые пластидные сигналы могут усиливать действие световых сигналов, как в нашем случае, или превращать их из индукторов в репрессоры генов белков фотосинтеза. Таким образом, несмотря на то, что гены ELIP и Lhcb2 относятся к одному и Рис. 10. Накопление транскриптов ELIP1, ELIP2, Lhcb2, HEMA1, HEMA2 и ChlH у тому же семейству, они регулируются поgun и hy мутантов и растений дикого типа разному световыми и пластидными сигналами, (ДТ) Arabidopsis. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и HEMA1), регулируются сходным образом, что согласуется с литературными данными (McCormac and Terry, 2002; Ruckle et al., 2007).

3.2. Влияние регуляторов роста растений и углеводов на экспрессию генов ELIP.

Изучение действия природного гормона - абсцизовой кислоты, ингибирующей рост растений, на экспрессию генов ELIP показало, что сигналы, индуцируемые АБК, в условиях светового стресса позитивно регулируют экспрессию генов ELIP, приводя к ее повышению в 2-2.5 раза (рис. 11).

Исследование участия АБК в передаче ретроградных сигналов с помощью gunмутантов показало, что у мутантов наблюдается некоторое снижение экспрессии этих генов.

В условиях фотодеструкции, вызванной НФ, АБК значительно ингибировала (на 80-90%) экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа и частично (~ на 50%) у gunмутантов (рис. 11).

Рис 11. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у gun5 мутантов и ДТ растений Arabidopsis, обработанных АБК, НФ (+) или в отсутствие ингибитора и гормона (-). 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Таким образом, АБК в условиях светового стресса позитивно регулирует экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа Arabidopsis, что согласуется с современными представлениями о механизме влияния АБК на экспрессию генов стрессовых белков (Wierstra and Kloppstech, 2000; Shen et al., 2006; Koussevitzky et al, 2007). Наши данные об экспрессии генов стрессовых белков при АБК-обработках gun5 мутантов, свидетельствуют в пользу ранее высказанных предположений о том, что ChlH (GUN5) участвует в передаче пластидных сигналов и восприятии АБК-сигналов (Shen et al., 2006). Поскольку у gunмутантов отсутствует рецептор сигналов, индуцируемых АБК, поэтому не было обнаружено повышения экспрессии ELIP при действии абсцизовой кислоты. Однако остается неясным, как СhlH выполняет роль посредника между пластидными и АБК-сигналами, участвуя в регуляции экспрессии генов. На основании этих данных можно также говорить о наличии связи между пластидными и АБК-сигналами.

Так как природный фитогормон АБК, ингибирующий развитие и рост растений, позитивно регулирует экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у растений Arabidopsis, представляло интерес рассмотреть, как влияют на экспрессию этих генов природные регуляторы роста растений, обладающие стимулирующим действием на процессы развития. Для экспериментов был выбран препарат нового поколения - мелафен Рис. 12. Содержание транскриптов (Патент РФ № 2158735, 2000).

генов ELIP1 и ELIP2 у растений ячменя, обработанных мелафеном Концентрация мелафена 0.5х10-8 М в разных концентрациях. 18S приводит к усилению роста растений и рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

повышению экспрессии гена высокомолекулярного стрессового белка ELIP2 (~ на 35%), однако, более высокие концентрации мелафена негативно влияют на экспрессию этого гена (рис. 12). При этом не было обнаружено влияния мелафена на экспрессию гена, кодирующего стрессовый белок пластид ELIP1. Во всех использованных концентрациях мелафен не влиял на содержание хлорофилла и каротиноидов (Осипенкова и др., 2008). Наши данные показали, что регулятор роста растений мелафен, повышая экспрессию генов стрессового белка хлоропластов ELIP2, видимо, влияет на биогенез хлоропластов и приводит к усилению защиты растений от различных стрессовых воздействий.

Таким образом, различные по механизму действия регуляторы роста растений могут сходно влиять на экспрессию генов ELIP.

Для того чтобы изучить участие углеводов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 проростки Arabidopsis были выращены на среде, содержащей 2%-ную или 7%-ную глюкозу. Как следует из полученных данных, глюкоза значительно ингибирует транскрипцию ядерных генов белков фотосинтеза ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа (~ на 80%) (рис. 13).

Рис. 13. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у растений gun5 Анализ содержания транскриптов у gunмутантов и дикого типа Arabidopsis, мутантов, выращенных на среде с 7% глюкозой, выращенных на среде с 2% или 7% глюкозой. 18S рРНК использовали показал, что экспрессия генов ELIP1 и ELIPдля стандартизации ОТ-ПЦР.

была снижена только на 60-70%.

Таким образом, изучение участия углеводов в экспрессии ELIP показало, что глюкоза в высокой концентрации ингибирует транскрипцию генов ELIP у растений дикого типа. У обработанных глюкозой gun5 мутантов было обнаружено, что нарушения биосинтеза тетрапирролов способствовали частичному восстановлению экспрессии. Это видимо, Рис. 14. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных gun указывает на связь углеводного статуса и мутантов и ДТ растений Arabidopsis, ретроградных сигналов, индуцируемых выросших в присутствии НФ (+) и без добавления ингибитора (-) на интермедиатами биосинтеза тетрапирролов.

среде без сахарозы. UBQНаличие сахарозы в среде для использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. выращивания также влияло на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP в условиях фотодеструкции. Как было сказано выше, экспрессия генов ELIP была значительно подавлена у НФ-обработанных растений дикого типа и восстанавливалась у gun5-1, gun мутантов, выращенных на среде, содержащей 2%-ную сахарозу (рис. 3, 4). Содержание транскриптов у тех же растений, обработанных ингибитором, но выращенных на среде без сахарозы, отличалось от содержания транскриптов генов ELIP у проростков, выращенных на содержащей сахарозу среде. Не наблюдалось восстановления транскрипции ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов, обработанных НФ и выращенных на среде без сахарозы. Результаты ОТ-ПЦР показали, что у ДТ растений в этих же условиях подавляется экспрессия генов ELIP1 и ELIPтолько на 70-80% по сравнению с растениями, выращенными на НФ-среде с 2%-ной сахарозой (рис. 14).

Можно предположить, что при фотодеструкции на транскрипцию ядерных генов не только влияют нарушения биосинтеза тетрапирролов, но и углеводный статус, что предполагает связь этих двух сигнальных путей. Наши данные согласуются с ранее опубликованными данными о регуляции экспрессии ядерных генов Lhcb и HEMA1 сахарами и GUN4, GUN5 ретроградными сигналами (McCormac and Terry, 2004).

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»