WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ОСИПЕНКОВА Ольга Валерьевна РОЛЬ РЕТРОГРАДНЫХ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ELIP1 И ELIP2 У Arabidopsis thaliana 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.В. ЕЛАНСКАЯ доктор биологических наук, профессор В.В. КУЗНЕЦОВ

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 18 2009 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хлоропласты являются не только центрами фотосинтетической деятельности растительных тканей, но принимают участие также в биосинтезе аминокислот, витаминов, пиримидинов, начальных этапах биосинтеза абсцизовой кислоты, восстановлении сульфатов и ряде других процессов. Хотя хлоропласты имеют собственный геном, большинство белков, необходимых для их функционирования, кодируется ядерным геномом и только небольшая часть кодируется геномом органелл (Leister, 2003; Одинцова и Юрина, 2003). Координированная экспрессия генов ядра и пластид, необходимая для развития и функционирования растительной клетки, достигается путем внутриклеточных взаимодействий ядра и пластид с помощью антероградного (от ядра к пластидам) и ретроградного (от пластид к ядру) механизмов регуляции (Taylor, 1989; Rodermel and Park, 2003). Важная роль ретроградных пластидных сигналов показана для биосинтеза хлорофилла, транспорта белков в органеллы и ответных реакций растений на стрессовые воздействия (Strand et al., 2003; Юрина и Одинцова, 2006). Роль таких сигналов выполняют продукты синтеза белка в пластидах, тетрапирролы (интермедиаты биосинтеза хлорофилла), а также редокс-состояние пула пластохинонов фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) пластид (Leister, 2003; Strand et al., 2003; Beck, 2005; Погульская и др., 2006;

Юрина и Одинцова, 2006; Осипенкова и др., 2007). Для исследования ретроградных пластидных сигналов используют genome uncoupled (gun) мутанты Arabidopsis с нарушенной передачей пластидных сигналов (Strand et al., 2003). Идентифицированы пять неаллельных gun мутантов, у которых экспрессия кодируемых ядром генов хлоропластных белков, таких как Lhcb1 и RbcS, увеличивалась на свету в присутствии гербицида норфлуразона, подавляющего синтез каротиноидов и вызывающего значительные фотоокислительные повреждения хлоропластов из-за образования активных форм кислорода (АФК).

Клонированные гены соответствовали пяти оригинальным локусам GUN1-GUN5, четыре из которых (GUN2-GUN5) кодировали белки, участвующие в метаболизме тетрапирролов (Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003). Было высказано предположение, что высшие растения могут использовать Mg-протопорфирин IX (Mg-Proto) и его монометиловый эфир (Mg-ProtoMe) в качестве сигнальных молекул хлоропластов (Woodson and Chory, 2008), хотя до сих пор этот вопрос остается спорным.

Так как растения постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, особый интерес приобретает исследование экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP (Early Light-Inducible Proteins), которые играют важную роль в защитных реакциях растений в ответ на действие стрессовых факторов. Эти белки синтезируются на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Grimm and Kloppstech, 1987;

Adamska et al., 2001). У высших растений низкомолекулярный (ELIP1) и высокомолекулярный (ELIP2) белки, относящиеся к мультигенному семейству светособирающих хлорофилл a/b-связывающих (LHC) белков, кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах, и в форме предшественников посттрансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane and Kloppstech, 2000).

Имеющиеся данные о ретроградных сигналах не позволяют судить о том, какие соединения являются сигнальными молекулами и как влияют пластидные сигналы на экспрессию генов белков светового стресса. Изучение экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов Arabidopsis поможет получить информацию о роли пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов фотосинтеза.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIPс помощью gun и hy (аллельных gun) мутантов Arabidopsis thaliana, характеризующихся нарушениями биосинтеза тетрапирролов.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить влияние нарушений передачи тетрапиррол-медиированного ретроградного пластидного сигнала на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2, а также корреляцию между экспрессией этих генов и содержанием хлорофилла на разных стадиях развития hy и gun мутантов Arabidopsis.

2. Выяснить роль предшественников биосинтеза тетрапирролов в экспрессии генов ELIP у hy и gun мутантов с помощью ингибиторного анализа и увеличения содержания Mgпротопорфирина IX. Определить содержание предшественников тетрапирролов (протопорфирина IX, Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира).

3. Изучить действие других типов пластидных сигналов (активных форм кислорода и редокс-состояния пула пластохинонов) на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2.

4. Изучить влияние некоторых сигнальных систем клетки (световой, гормональной и углеводной) на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.

Научная новизна. Впервые показано, что нарушения в HY1, HY2 и GUN4 (но не GUN5) сигнальных путях приводят к изменению экспрессии генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2. Ретроградные пластидные сигналы негативно регулируют экспрессию этих генов. Выявлены различия в световой и пластидной регуляции экспрессии генов близкородственных белков ELIP и Lhcb и генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла. Впервые показано, что интермедиаты биосинтеза тетрапирролов - Mg-Proto и его монометиловый эфир - влияют на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2, возможно, опосредованно через АФК и редокс-состояние компонентов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) хлоропластов. Эти тетрапирролы непосредственно не участвуют в регуляции экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. Обнаружена обратная корреляция между экспрессией генов ELIP1 и ELIP2 и содержанием хлорофилла у gun мутантов. Показано, что белки ELIP модулируют синтез хлорофилла, предотвращая накопление свободного пигмента и, таким образом, фотоокислительный стресс.

Научно-практическая ценность. Детальное изучение молекулярных механизмов экспрессии генов и путей передачи сигналов, регулирующих экспрессию генов, необходимых для функционирования ядра и хлоропластов, является перспективным.

Биохимические и молекулярно-биологические методы и подходы, используемые при изучении этих механизмов, не уступают мировому уровню и являются пионерскими.

Выявление процессов, участвующих в генерации и передаче пластидных сигналов, имеет не только самостоятельный научный интерес, но и позволяет расширить представления о механизмах передачи сигналов и координированной регуляции экспрессии ядерных генов пластид. Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, необходима для дальнейших исследований в этом направлении. Эти результаты могут быть использованы для регуляции процессов фотосинтеза, который определяет продуктивность сельскохозяйственных растений.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных симпозиумах «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Россия, Татарстан, Казань, 2006); “Photosynthesis in the post-genomic era:

structure and function of photosystems” (Россия, Пущино, 2006); «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященном 100-летию акад. Н.М. Сисакяна (Россия, Дубна, 2007; Армения, Ереван, 2007) и на международной конференции FEBS "Origin and evolution of mitochondria and chloroplasts" (Италия, Маратея, 2007), а также на VI съезде общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Россия, Коми, Сыктывкар, 2007) и семинаре кафедры физиологии растений университета им. А. Гумбольдта «Retrograde signaling in plants» (Германия, Берлин, 2008).

Публикации. Опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, 1 статья в сборнике и 6 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников). Диссертация изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы В обзоре литературы дана общая характеристика антероградных и ретроградных сигналов. Детально рассмотрены современные представления о роли тетрапирролов, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии ядерных генов белков пластид. Дан краткий обзор биосинтеза тетрапирролов. Приведено краткое описание некоторых сигнальных систем клетки и их роли в экспрессии ядерных генов белков, участвующих в фотосинтезе, а также структуры и функций белков ELIP.

Материалы и методы исследования Растения и условия выращивания.

В работе были использованы мутанты (hy, gun) и растения дикого типа (ДТ) Arabidopsis thaliana (Arabidopsis): gun5 мутанты были предоставлены проф. Дж. Чори (The Salk Institute for Biological Studies, USA); gun5-1 и gun4 мутанты были получены от ABRC (Ohio State University, USA); hy1 (gun2) и hy2 (gun3) мутанты были получены от проф. А.

Смит (University of Cambridge, UK). Поверхностно стерилизованные семена растений проращивали в стерильных чашках Петри на 2xMС (Murashige and Scoog) среде в течение дней при режиме 8 ч свет/ 16 ч темнота, низкой освещенности (LL) (30 µмоль м-2 с-1) и температуре 20-23° С. Для экспериментов со взрослыми растениями проростки растили в земле в течение 30 дней на свету стандартной интенсивности (SL) (70 µмоль м-2 с-1).

Некоторые чашки с семенами подвергали 30-мин экспозиции на свету (70 µмоль м-2 с-1) и затем помещали в темноту для прорастания в течение 10 дней. Семена ячменя (Hordeum vulgare L) проращивали в чашках Петри на смоченной водой фильтровальной бумаге при 2023° С в темноте или при освещении (12 ч свет/ 12 ч темнота) в течение 7 дней. Растения перед всеми опытами выставляли на свет высокой интенсивности (HL) (350 или 550 µмоль м2 с-1), либо холод (10° С) на 2 ч для индукции белков светового стресса пластид ELIP.

Обработка растений.

Норфлуразон (НФ) добавляли в среду для выращивания растений в концентрации µМ, или растения опрыскивали на свету ежедневно в течение одной недели раствором НФ той же концентрации. С 5 мМ 2,2'-дипиридила (ДП) растения инкубировали в течение 8 ч (ч при 20-23° C и 2 ч при 10° C). Ацифлуорфен (АФ) добавляли в среду (0.05 µM) или опрыскивали им растения (1, 5, 10, 20, 30 и 50 µM) в течение трех дней. В опытах с интермедиатами тетрапирролов инкубацию листьев проводили в водном растворе 50 µМ MgProto в течение 5 ч (3 ч при 20-23° C и 2 ч при 10° C). Инкубацию с 1 мM 5аминолевулиновой кислоты (АЛК) проводили в течение 2 ч в условиях HL. Для ингибирования фотохимической активности фотосистемы 2 (ФС2) растения инфильтрировали водным раствором 120 µМ 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины (диурон). Для опытов с абсцизовой кислотой (АБК) или глюкозой растения в течение 4 дней выращивали на стерильных бумажных фильтрах, погруженных в 2хMС среду, содержащую 2% сахарозу. Затем их переносили на среду, содержащую 5 M АБК или 7% глюкозу, и выращивание продолжали еще в течение 6 дней. Семена ячменя замачивали в водном растворе меламиновой соли бис(оксиметил)-фосфиновой кислоты (мелафена) различной концентрации (0.5х10-10 М; 0.5х10-8 М; 0.5х10-5 М; 0.5х10-3 М) в течение 2 ч.

Выделение РНК.

Из гомогенизированных образцов растений с помощью набора «RNeasy Plant Mini kit» («QIAGEN», Германия), «TRIsure» («BIOLINE», Германия) или «YellowSolve» («Клоноген», Санкт-Петербург, Россия) выделяли суммарную РНК в соответствии с рекомендациями производителей. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Электрофорез проводили при напряжении 70 В в течение 1 ч в 1хМОРS буфере (0.2 М MOPS; 50 мМ ацетат Na; 1 мМ ЭДТА, рН 8.0). РНК предварительно смешивали с 10 µл буфера для нанесения «LoadingMix» (10хMOPS - 10 µл, 37% формальдегид - 35 µл, 100% формамид - 100 µл, стерильная вода - 53 µл, 0.5 µг/мл этидий бромид (EthBr - 2 µл), прогревали при 65° С в течение 5 мин и наносили на 1.5% агарозный гель. Флуоресценцию комплекса РНК-EthBr обнаруживали в УФ-свете (трансиллюминатор ТСР-15М «Vilber Lourmat», Франция) и анализировали с использованием видеосистемы «DNA Analyzer» («Хеликон», Россия) и «AlphaEaseFS StandAlone» («Alpha INNOTECH», «BIOZYM», Германия).

Подбор праймеров.

Праймеры для последовательностей генов ELIP1, ELIP2, 18S рРНК, UBQ10, ChlH, Lhcb2, HEMA1 и HEMA2 Arabidopsis и ячменя выбирали с помощью программы «PrimerInput 0.4.0» (http://frodo.wi.mit.edu) и заказывали у фирм «БиоТехЛит» (Россия) или «SIGMAAldrich» (Германия). Последовательности праймеров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Специфические праймеры, использованные для ПЦР.

название номер в базе последовательность длина темп. длина ПЦР направление гена генов праймеров (5-3) праймера отжига продукта, п.н.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»