WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Миобласты Клетки рабдомиосаркомы Клетки предстательной железы Рисунок 8. Белок NM23B и некоторые «постоянные» белки в культивируемых клетках человека. Белая пунктирная стрелка – кофилин, сплошная белая стрелка – циклофиллин, черная стрелка – белок NM23B.

Наличие белка NM23B в злокачественных, но не в нормальных клетках (рис. 8), позволяет рассматривать его как белок, потенциально вовлеченный в процессы опухолевой трансформации.

Таблица 4. Результаты идентификации белков, рассматриваемых в качестве онкомаркеров № Наименование белка № в базе % Мол. масса, кДа/pI данных перекрытия эксперимен- расчетные NCBI тальные 1 AGR2 55628194 72 17,0/9,10 20,0/9,2 Белок теплового шока 4008131 63 10,0/7,80 10,5/9,10 кДа 3 Белок NM23B 12803317 61 17,5/8,37 17,3/8,4 Белок DJ-1 50513593 40 22,0/6,30 20,0/6,Среди белков, идентифицированных только в клетках рака предстательной железы, оказался белок AGR2, рассматривающийся как потенциальный маркер процессов опухолевой трансформации в предстательной железе [Ковалев и др., 2006; Zhang et al., 2007]. Сравнительный анализ белкового состава нормальных и опухолевых клеток человека и ткани предстательной железы показал, что белок AGR2 присутствует в ткани и культивируемых клетках рака предстательной железы. В нормальных клетках и тканях, а также в злокачественных мышечных клетках белок AGR2 обнаружен не был (Рис.9).

Ткань ГПЖ Ткань РПЖ Культивируемые клетки РПЖ Клетки рабдо- Миобласты Фибробласты миосаркомы Рисунок 9. Сравнительный анализ присутствия белка AGR2 в нормальных и опухолевых клетках человека и ткани предстательной железы. ГПЖ – гиперплазия предстательной железы, РПЖ – рак предстательной железы. Белая стрелка указывает на циклофиллин, присутствовавший во всех представленных клетках и тканях. Черная стрелка указывает на белок AGR2.

Наличие этого белка в культивируемых клетках рака предстательной железы позволяет рассматривать их как потенциальную экспериментальную модель для изучения опухолевой трансформации на доклинической фазе испытаний, в то время как клетки рабдомиосаркомы могут выступать в качестве контроля (как клетки, являющиеся злокачественными, но не содержащими указанный белок).

Оптимизация клеточной тест-системы для определения биологического эффекта ростовых факторов, способных подавлять пролиферацию миобластов человека.

Разработка технологий получения биологически активных субстанций рекомбинантных белковых факторов роста требует наличия соответствующих методов определения физиологической активности получаемых препаратов.

Влияние препарата механозависимого Влияние препаратов миостатина на ростового фактора на миобласты человека А Б миобласты человека 140% 120% 160% 140% 100% 120% 80% 100% 60% 80% 60% 40% 40% 20% 20% 0% 0% 0 1 3 5 10 20 БСК 0 0.1 0.25 0.5 1 2,5 Концентрация, мкг/мл Концентрация, мкг/мл В Рисунок 10. Выявление биологической активности различных фракций, получаемых при выделении и очистке рекомбинантных факторов роста. Тест-объект – культивируемые миобласты человека. Окраска кристаллическим фиолетовым. А - график, характеризующий влияние физиологически активного препарата механозависимого ростового фактора на культивируемые миобласты человека. Б - графики, характеризующие физиологический (сплошная линия, подавление пролиферации в концентрации 3-10 мкг/мл без цитотоксического эффекта) и цитотоксический (пунктирная линия, эффект в концентрациях от 1 мкг/мл). В – микрофотографии миобластов человека в контроле, содержащем сыворотку (1), в бессывороточном контроле (3), а также под действием различных препаратов миостатина (2, 4). Окраска кристаллическим фиолетовым. Отсутствие клеток в одном из образцов, подвергнутом воздействию миостатина (4), объясняется цитотоксическим действием указанного препарата.

Ранее разработанная с этой целью клеточная тест-система способна определять рост-стимулирующий и цитотоксический эффекты исследуемых препаратов, но не степень подавления пролиферации [Черников и др., 2001]. В связи с этим она нуждалась в определенных модификациях, позволяющих использовать ее для определения подавляющего пролиферацию эффекта исследуемых субстанций. Для этого было предложено использование бессывороточного контроля, то есть образцов клеток, инкубируемых в бессывороточной среде. Клетки в культуре растут под действием ростовых факторов, содержащихся в добавляемой к культуральной среде сыворотке. В отсутствие последней клетки практически не делятся, что позволяет Относ.

оптическая плотность Относ.

оптическая плотность рассматривать бессывороточный контроль как пример полного подавления пролиферации клеток.

Тестирование ряда препаратов миостатина и механозависимого фактора роста показало, что часть препаратов обладает свойственным им биологическим эффектом, в то время как другие препараты не обладают эффектом или вызывают гибель клеток (рис. 10).

Биологически активный препарат миостатина способен практически полностью подавить пролиферацию миобластов, индуцируемую эмбриональной телячьей сывороткой, не оказывая при этом цитотоксического эффекта. Часть препаратов механозависимого фактора роста стимулировала рост миобластов, другие же препараты не оказывали влияния на пролиферацию миобластов.

ВЫВОДЫ.

1. С помощью протеомного анализа белков в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах человека:

а) идентифицировано 42 белковых фракции, в том числе актин, кальций- и актин-связывающие белки (кофилин, кальдесмон, трансгелин, тропомиозины, S100A10, S100A11), белки теплового шока и другие.

б) выявлено и идентифицировано 11 белковых фракций, количество которых значительно уменьшалось при дифференцировке; уменьшение количества немышечной формы кофилина и белка S100A11 предлагается рассматривать как ранние признаки, отражающие дифференцировку одноядерных пролиферирующих миобластов с немышечным типом подвижности в многоядерные миотубы.

в) в дифференцирующихся миобластах обнаружено увеличение 2 белковых фракций; появление изоформы 1 -тропомиозина, типичной для зрелых мышечных клеток, можно рассматривать как один из ранних признаков дифференцировки миобластов.

2. В культивируемых миобластах человека обнаружено 3 новых белка (Мм/pI 38,0/4,90; 59,0/8,30; 58,0/7,90), сходных с гипотетическими белками – потенциальными продуктами трансляции транскриптов, зарегистрированных в базе данных NCBI.

3. По итогам сопоставления результатов протеомного анализа с информацией баз данных NCBI и Swiss-Prot подтверждено существование по одному из вариантов для 40 расчетных «конфликтных» определений в аминокислотных последовательностях 12 идентифицированных белков культивируемых мышечных клеток человека.

4. Сравнительное изучение белкового состава нормальных и опухолевых культивируемых клеток мышечного и эпителиального происхождения позволило идентифицировать в клетках рабдомиосаркомы и рака предстательной железы 3 белка (NM23B, DJ-1 и шаперонин-10), рассматриваемых в качестве потенциальных онкомаркеров; белок AGR2, рассматриваемый как потенциальный маркер рака предстательной железы, был обнаружен только в клетках рака предстательной железы.

5. Клеточная тест-система, использующая в качестве тест-объекта культивируемые миобласты человека, оптимизирована для определения активности рекомбинантных ростовых факторов и других биологически активных веществ, подавляющих пролиферацию клеток.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи в рецензируемых журналах 1. Шишкин С.С., Крохина Т.Б., Ахунов В.С., Макаров А.А., Попов В.О.

Влияние миостатина и некоторых других ростовых факторов на культивируемые клетки человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2004, т.40, №6, с.630-633.

2. Еремина Л.С., Ковалев Л.И., Шишкин С.С., Торопыгин И.Ю., Буракова М.В., Ковалева М.А., Макаров А.А., Дзеранов Н.К., Казаченко А.В., Тотров К.И., Кононков И.В., Лоран О.Б. Биохимический полиморфизм трансгелинов в предстательной железе человека при гиперплазии и раке. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. №3, 2007, c.49-52.

3. Еремина Л.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Макаров А.А., Шишкин С.С., Буракова М.И., Чернов Н.Н., Торопыгин И.Ю., Кононков И.В.

Cравнительное изучение белка AGR2 в некоторых культивируемых клетках и образцах тканей простаты. Вестник РУДН. Серия «Медицина». 2007, №6.

С.271-276.

4. Kuznetsova TV, Schulga AA, Wulfson AN, Keruchenko JS, Ermolyuk YS, Keruchenko ID, Tikhonov RV, Lisitskaya KV, Makarov AA, Chobotova K, Khomenkov VG, Khotchenkov VP, Popov VO, Kirpichnikov MP, Shevelev AB.

Producing human mechano growth factor (MGF) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 2008 Vol. 58. №1, p. 70-77.

5. Ковалева M.А., Ковалев Л.И., Еремина Л.С., Макаров А.А., Буракова М.В., Торопыгин И.Ю., Серебрякова М.В., Шишкин С.С., Арчаков А.И.

Определение «аминокислотных конфликтов» и аминокислотных замен в первичных структурах 41 белка человека протеомными технологиями.

Биомедицинская химия. Т.54, №4, 2008. С. 420-434.

6. Макаров А.А., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С.

Изучение изменений белкового профиля в дифференцирующихся миобластах человека. Онтогенез. 2009, Т.40, №2, С.112-119.

Статьи в сборниках 7. Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Макаров А.А., Шишкин С.С., Тихонова О.В., Мошковский С.А., Серебрякова М.В. Протеомные технологии в исследованиях проблемы гипертрофии мышечных клеток (возможности тестирования молекулярных эффектов при использовании медикобиологических технологий повышения работоспособности). Сб. статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Москва, 2004, с.160-168.

8. Шишкин С.С., Крохина Т.Б., Ахунов В.С., Макаров А.А. Определение с помощью клеточной биотест-системы функциональной активности некоторых ростовых факторов, влияющих на состояние опорнодвигательного аппарата. Сб. статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Москва, 2004, с. 169-177.

9. Шишкин С.С., Макаров А.А., Ахунов В.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Князев А.И., Воронина А.С., Лисицкая К.В., Еремина Л.С. Создание и использование лабораторного регламента для определения биологической активности рекомбинантных ростовых факторов и некоторых других биологически активных веществ. Сб. статей «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок». Вып. 2. Москва, 2006, с.8-22.

Тезисы докладов 10. Макаров А.А., Ковалев Л.И., Лисицкая К.В., Еремина Л.С., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Исследование изменений белкового профиля культивируемых скелетно-мышечных миобластов человека в ходе миогенной дифференцировки. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре». Цитология, 2006, т.48, №9, с.778.

11. Макаров А.А., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Лисицкая К.В., Еремина Л.С., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Изучение изменений белковых продуктов генной экспрессии в культивируемых миобластах человека при миогенной дифференцировке. Аннотации докладов 3-го Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии». Дубна, 2006, с.45.

12. Makarov A., Kovalyov L., Lisitskaya K., Toropygin I., Shishkin S. Effect of mechano growth factor on protein profile of cultured human myoblasts. Abstracts of the 6th Parnas Conference «Molecular Mechanism of cellular signalling». Acta Biochimica Polonica, vol.54, suppl.2, 2007, p.22.

13. Makarov A., Kovalyov L., Lisitskaya K., Shishkin S. Dynamics of S100Aprotein in human myoblasts after stimulation of differentiation. Abstracts of the 32th FEBS Congress “Molecular Machines”. FEBS Journal, vol.274, suppl.1, 2007, p.139.

14. Макаров А.А., Ковалев Л.И., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С. Возможное физиологическое объяснение изменения количества белка S100A11 в дифференцирующихся миобластах человека. Тезисы докладов 2-го Съезда общества клеточной биологии. Цитология, 2007, т.49, №9, с.773.

15. Makarov AA, Kovalyov LI, Kovalyova MA, Toropygin IYu, Shishkin SS.

S100A11 protein in normal and malignant skeletal muscle cells. Materials of 37th European Muscle Conference, Oxford, 2008, p.121.

16. Makarov AA, Kovalyov LI, Kovalyova MA, Toropygin IYu, Shishkin SS. Study of S100 proteins in human normal and malignant cells and tissues. Materials of 10th European Symposium on Calcium-binding Proteins in Normal and Transformed Cells, 2008, C-31.

17. Макаров А.А., Ковалев Л.И., Ковалева М.А., Торопыгин И.Ю., Шишкин С.С.

Изучение белка S100A11 и немышечной формы кофилина в культивируемых мышечных клетках и зрелой скелетной мышце человека. Тезисы докладов Школы молодых ученых «Методы культивирования клеток», Цитология, 2008, т.50, №9, с.814-815.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»